基于四逆湯建立附子炮制新方法

陳 雪，王冬閣，馮正平，李嘉欣，張國彥，劉志超，康杰芳，崔浪軍?

（1.陜西師范大學生命科學學院，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西 西安710062； 2.城固縣群利中藥材合作社，陜西 漢中723200）

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum camichaeliDebx.的子根加工品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效［1］。現代藥理學研究發現此類中藥具有良好的抗炎、鎮痛、免疫抑制、抗腫瘤、強心、降血壓、擴張血管等作用，用于治療慢性風濕病、慢性心力衰竭、慢性腎功能衰竭等［2］。附子中的生物堿是其最受關注的活性物質，炮制加工有助于毒性成分雙酯型生物堿向有效成分單酯型生物堿轉化以達到減毒增效的目的。目前附子炮制方法主要有2 種形式，一種為無膽附片，如烘烤品、古代干熱品、砂燙品、清炒品、蒸附片；另一種為2015 年版《中國藥典》 中所載的有膽附片，如黑順片、白附片、鹽附子等炮制品種。無論在附子炮制過程中是否有膽巴參與，增加藥效并降低毒性始終為其加工炮制中最關注的問題。

附子最初以鹽制居多，主要由于附子有“隔夜腐” 的特質，以鹽制在減毒的同時可以起到防腐作用，延長加工周期。在附子加工炮制過程中，高濃度膽巴浸泡后，附子中膽巴累積量可達26%［3］，這給后續附片加工帶來諸多不便。漂洗退膽過程會使附片中生物堿大量流失［4］，退膽不盡甚至影響附片臨床用藥安全，嚴重的可致人昏迷，甚至呼吸麻痹和休克，更甚者循環衰竭死亡［5-6］。采用烘烤、砂燙、蒸制等方法炮制的無膽附片，如炮附子與蒸附片等炮制品種，其有效成分含有量較高，毒性成分含有量低［7-8］，抗炎鎮痛作用效果相似［9］。故優化附子無膽巴炮制加工工藝，生產質優效佳的附片具有十分重要的意義。

古籍中有大量附子與姜和甘草相配伍的記載，有“附子得甘草而后緩”［10］和 “附子無 姜不熱”［11］的說法。據《本草正》 中所述甘草有“毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性，表藥得之助其外，下藥得之緩其速”［12］的功效。《傷寒論》 和《金匱要略》 中記載的含有附子的方中，大多配伍甘草以降低附子的毒性［13-16］，并且甘草對于緩解服用附子中毒癥狀也有顯著效果［17］。附子與干姜或生姜配伍后均可增強其熱性，干姜的加入使附子增強心率的作用更為強烈［18］，且經干姜或生姜拌蒸制得到的附片，其毒性也可減弱［19］。張仲景在《傷寒論》 中提到的四逆湯方中，將干姜與甘草同時與附子配伍，有回陽救逆、溫中散寒的功效。本研究基于傳統經方四逆湯的配伍理念，在無膽蒸制附片的炮制方法的研究基礎上，結合現代酶提取工藝，開發新型的優質無膽蒸附片，并規范其生產工藝，明確炮制參數，以期為附片炮制加工工藝的革新提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AT 高效液相色譜儀配有SPD-20 A 紫外檢測器，島津LC-solution 工作站，SIL-20 A 自動進樣器，LC-20AT 二元泵，CBM20 A系統控制器，DGU-20 A 脫氣機（日本島津株式會社）；高壓滅菌鍋（上海諾頂儀器設備有限公司）；電子天平［賽多利斯科學儀器 （北京） 有限公司］；超純水機（美國Milli-pore 公司）；粉碎機（永康紅太陽機電有限公司）。

1.2 試劑與試藥 苯甲酰新烏頭原堿（A0632，純度99.56%）、苯甲酰次烏頭原堿（A0633，純度99.66%）、苯甲酰 烏頭原 堿 （A0631，純 度98.90%）、烏頭堿（A0196，純度98.01%）、次烏頭 堿 （A0906，純 度 99.04%）、新烏頭 堿（A0608，純度98.12%），均購于成都曼斯特生物科技有限公司。色譜純乙腈、二乙胺、甲醇均購于美國Fisher Chemical 集團；分析純檸檬酸、檸檬酸鈉、氨水、異丙醇、乙酸乙酯均購自天津天利化學試劑有限公司。甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.及干姜Zingiber officinaleRosc.飲片購自北京同仁堂。附子于8 月份采挖自陜西省漢中市城固縣，經陜西師范大學西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室崔浪軍副教授鑒定為毛茛科植物烏頭屬烏頭Aconitum camichaeliDebx 的子根。

2 方法與結果

2.1 炮制工藝 新鮮附子洗凈，縱切成0.5 cm 厚附片，常溫下晾干至恒定質量，備用。取30 g 干附片，加入溶有纖維素酶與果膠酶的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.8），混合均勻，50 ℃恒溫恒濕箱中靜置30 min，取出，晾至室溫。加入甘草與干姜過3 號篩的混合粉，高壓蒸制后，35 ℃烘干，粉碎后過3 號篩，備用。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿對照品各1 mg，精密加入甲醇1 mL，搖勻，制成1 mg／mL 的對照品溶液。4 ℃冰箱中備用。

2.2.2 供試品溶液 分別取各樣品粉末2 g，平行3 份，置具塞錐形瓶中，加25% 氨水3 mL，浸潤30 min。精密加入異丙醇-醋酸乙醇（1 ∶1） 混合溶液50 mL，密塞，稱定質量。超聲處理（300 W，40 kHz） 30 min，水溫在25 ℃以下，放冷，再稱定質量，用異丙醇-醋酸乙醇（1 ∶1） 混合溶液補足減失質量，搖勻后過濾。精密量取續濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入甲醇溶液2 mL，轉移至離心管，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件 Phenomenex RP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 二乙胺（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，28% A；8～12 min，28%～33% A；12～45 min，33%～50% A；45～55 min，50% A）；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗稱取生附子粉末，按“2.2.1” 項下方法制備對照品溶液，在“2.3” 項條件下進樣6 次，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含有量RSD 分別為1.32%、0.75%、0.61%、1.22%、0.45%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 線性關系考察 精密稱取各單對照品適量，分別配制為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg／mL 的系列對照品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣10 μL，測定峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X）、峰面積積分值為縱坐標（Y） 進行線性回歸。結果見表1，表明6 種生物堿在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 穩定性試驗 選取供試品，在“2.3” 項條件下進樣，分別于0、1、4、8、12、24 h 進樣，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含有量RSD 分別為 1.21%、0.43%、0.72%、0.87%、1.60%、1.73%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 選取附子飲片粉末6 份，每份2 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣。測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及苯甲酰烏頭原堿含有量RSD 分別為2.00%、0.59%、0.007%、1.25%、0.07%、0.59%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取“2.2.1” 項下已知含有量的附片粉末，分別加入與樣品中等量的對照品。按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項條件下進樣。計算苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的平均回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

2.5 生物酶對新型附片的影響 取6 等份干附片（30 g／份），分別加 入溶有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g 的不同比例的混合酶粉［果膠酶-纖維素酶（1 ∶0、3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、0 ∶1）］ 的緩沖液于干附片中，攪拌均勻。置于50 ℃恒溫恒濕箱中30 min，取出，晾至室溫，于35 ℃烘干。粉碎后過3 號篩，在“2.3” 項條件下進樣。計算效毒比值（苯甲酰新烏頭原堿量／雙酯型生物堿量），以全面分析附子在炮制過程中化學成分的變化［17］，效毒比可體現附子中毒性成分與有效成分的流失比例，效毒比越大，毒性成分的流失程度越高于有效成分的流失程度。

2.6 粉用法對新型附片的影響 取6 等份干附片（30 g／份），將溶有0.2 g 混合酶粉［果膠酶-纖維素酶（1 ∶2）］ 的緩沖液依次加入6 等份干附片中，酶反應階段與“2.5” 項下操作相同。以不加粉的附片為參照，其余分別加入干姜粉、甘草粉及混合粉（1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1） 至掛粉均勻且不掉粉，35 ℃烘干，粉碎后過3 號篩，在“2.3” 項條件下進樣分析。

2.7 蒸制時間對新型附片的影響 取4 等份干附片（30 g／份），酶處理與“2.6” 項下操作相同。加入混合粉至掛粉均勻且不掉粉。分別置于高壓蒸制設備蒸制20、30、40、50 min，35 ℃烘干，在“2.3” 項條件下進樣測定烏頭堿含有量。

3 結果

3.1 生物酶對新型附片的影響 表3 表明，加入果膠酶與纖維素酶后，隨著細胞壁結構被破壞，細胞壁中生物堿溶出。未加入酶時，附片的效毒比為2.111；加入酶后，附片的效毒比降低，當加入酶量為0.8 g 時，果膠酶-纖維素酶（2 ∶1），飲片效毒比達到最低為1.482。當加入酶量為0.2 g 時，果膠酶-纖維素酶 （1 ∶2），飲片效毒比達到最高2.732。

表3 附子飲片加入不同酶粉后的效毒比Tab.3 Ratio of active ingredients to toxic ingredients in Aconiti Lateralis Radix Praeparata decoction pieces after being added with different enzyme

3.2 甘草與干姜粉對新型附片的影響 表4、圖2顯示，無論是分別加入甘草粉及干姜粉還是加入兩者的混合粉，附子飲片效毒比均呈現顯著性增強。與無粉組附片比較，干姜與甘草處理組的總生物堿含有量均顯著性提高，雙酯型烏頭堿含有量降低，苯甲酰新烏頭堿含有量在甘草組中無顯著變化，而在干姜處理組顯著增加。甘草與干姜配合使用時，與無粉組比較，苯甲酰新烏頭原堿含有量及總生物堿含有量均提高（P＜0.01），而雙酯型烏頭堿含有量降低。其中，當甘草-干姜（1 ∶2） 的比例配合使用時，雙酯型烏頭堿含有量降低至極顯著水平，此時附子飲片效毒比最高。圖3 表明，當加入干姜粉比例增大時，新烏頭堿水解程度先增加后減小，烏頭堿水解程度增大。隨甘草粉比例增大，次烏頭堿水解程度增大。

表4 附子飲片加入輔料后的效毒比Tab.4 Ratio of active ingredients to toxic ingredients in Aconiti Lateralis Radix Praeparata decoction pieces after being added with different power

3.3 蒸制時間對新型附片的影響 表5、圖4 顯示，生物堿在高壓蒸制過程中存在損失，其總生物堿含有量均有所降低。隨蒸制時間增加，苯甲酰新烏頭原堿的含有量逐漸增高。當蒸制時間為40 min時，雙酯型烏頭堿含有量達到最低0.01%。

圖2 不同輔料對生物堿含有量的影響Fig.2 Effects of different excipients on alkaloid content

表5 不同時間蒸制后附子飲片的效毒比Tab.5 Ratio of active ingredients to toxic ingredients in Aconiti Lateralis Radix Praeparata decoction pieces with different steaming time

4 討論

圖3 不同輔料對生物堿轉化的影響Fig.3 Effects of different power on alkaloid conversion

烏頭類中藥飲片炮制是否得當，直接關系到臨床使用的安全性和有效性，因此對該類中藥材炮制工藝進行相關研究具有重要意義［20］。酶提取法以其高效、專一、反應條件溫和的特點已成為植物提取中的常用提取手段，被靈活應用于化妝品［21］、食品［22］和日用品生產中。中藥提取工藝中，相應的酶也被作為浸提輔助劑來促進中藥中多酚［23］、多糖［24］等有效成分的溶出。由于生物堿水溶性較差，因此用酶法提取時常營造酸性環境以增加生物堿的溶出［25］。張福維等［26］通過加入15 mg／g 纖維素酶與10 mg／g 果膠酶，在pH 4.5 的緩沖液環境下使得長春堿提取率達到0.48%；梁柏林等［27］通過加入30 mg／g 纖維素酶，在40 ℃、pH 4.0 的條件下酶解黃連90 min 以提取小檗堿，此方法較傳統乙醇浸提法提取率提高49%；魏金瑩［28］在貝母總生物堿提取中加入纖維素酶，較不加酶提取率提高39.2%。本研究在炮制過程中所使用的纖維素酶與果膠酶在干附片潤濕時可迅速破壞植物細胞壁，促進生物堿的溶出。同時因附子毒性較強，引入效毒比概念作為評價附子質量和反映其安全性，可較單一生物堿含有量更為全面地反映附子在炮制過程中的差異［29］。效毒比越大，附子藥效越強、毒性越弱，用藥安全性越高［30］。

附子與甘草配伍屬于酸堿對藥，甘草中甘草羧酸與生物堿中叔胺發生締合形成沉淀物鹽類進而降低附子毒性［31］。甘草酸對烏頭堿有控釋和促進水解的雙重作用［32］。郭艷麗等［33］推測由于干姜通過對代謝酶CYP3A4 酶的抑制，減慢附子主要藥效成分烏頭類生物堿的代謝，延長在體內滯留時間，進而達到增強附子藥效的作用。

附子炮制過程中生物堿的水解轉化規律尚不明確，但現代研究表明附子經過加水和加熱處理使其毒性降低［31］。本研究結果表明，甘草可有效結合附子中的烏頭堿使其含有量降低，且隨干姜使用量的增加附子中苯甲酰新烏頭原堿的含有量也有所增加。而次烏頭堿與苯甲酰次烏頭堿轉化不一致，推測其進一步水解為次烏頭堿原堿。由此可知干姜與甘草的加入促進了雙酯型生物堿向單酯型生物堿的轉化。已知濕熱蒸制附子既可避免膽巴處理導致的生物堿大量流失，又可減輕附子毒性［34］。

本研究炮制的新型飲片避免了傳統膽巴炮制工藝中膽巴殘留引起的毒性反應，且避免了附子腐爛造成的經濟損失。該新附片炮制方法簡便、高效、安全且可提高附子利用價值，可作為替代附子傳統加工工藝的新方法。