通迪膠囊對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的影響

吳曉東，黃閏月，陳秀敏，王茂杰，趙 越，伍嘉琪

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 是一種以關節(jié)軟骨病變，滑膜細胞增生為特征的系統(tǒng)性、炎性自身免疫性疾病［1］。目前認為免疫細胞及其分泌的細胞因子的調(diào)節(jié)失衡是RA 發(fā)病過程的核心免疫機制［2］，其中自身反應性T 細胞在RA 免疫紊亂中起著關鍵作用［3］。由于RA 的難治性和機制的復雜性，現(xiàn)有方案的治療效果仍有待進一步改善［4］，因此，RA 治療藥物的研發(fā)仍然迫切。中醫(yī)藥治療RA 效果顯著，但是很多有效藥物的機制仍然不明，限制了其臨床廣泛應用。通迪膠囊是純中藥制劑，具有活血行氣、散瘀止痛的功效，被廣泛用于各種風濕關節(jié)病。本研究以Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠為研究對象，探討通迪膠囊對CIA 小鼠關節(jié)炎癥與細胞免疫功能的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雌性BALB／c 小鼠29 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2016-0006。

1.2 藥物與試劑 通迪膠囊（批號20170714，貴州景誠制藥有限公司）；雞Ⅱ型膠原 （批 號120257，美 國Chondrex 公司）；弗氏完全佐劑 （批號SLBT1714，美國Sigma 公司）；PE 偶聯(lián)小鼠CD4 抗體（批號7312859，美國BD 公 司）；Mouse Th1／Th2／Th17 Phenotyping Kit （批 號8019831，美 國BD 公 司）；Transcription Factor Buffer Set（批號7282590，美 國BD 公 司）；甲氨蝶呤片 （批 號036170502，上海上藥信誼藥廠有限公司）。

2 方法

2.1 造模 選用BALB／c 小鼠作為實驗對象，雞Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol／L 冰醋酸中，使其終質(zhì)量濃度為2 mg／mL，4 ℃過夜，次日，將溶解的膠原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化（冰上操作） 至油包水狀，使膠原濃度為1 mg／mL；初次免疫時，于BALB／c 小鼠足底皮下和尾根部皮下2～3 cm 處注射100 μL 乳化膠原；2 周后，以相同劑量再次加強免疫，肉眼觀察小鼠四肢，每隔3 d 采用游標卡尺測量小鼠左右后足踝關節(jié)下0.5 mm 處的直徑值，作為關節(jié)腫脹度的指標。

2.2 分組、給藥 根據(jù)動物的存活率和模型成功率，將以上造模成功Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠隨機分為模型組（5 只）、甲氨蝶呤組（8 只），通迪膠囊組（11 只），另設空白組5 只。各組動物于第1 次免疫第16 天后，通迪膠囊組灌胃給予通迪膠囊溶液0.55 g／kg，1 d／次；甲氨蝶呤組每周灌胃給予2 次甲氨蝶呤溶液2.055 mg／kg；空白組、模型組每天給予生理鹽水；連續(xù)給藥50 d。給藥劑量按照實驗動物與人臨床用藥量的換算公式計算得出。

2.3 腫脹度的測定 根據(jù)參考文獻［5］，每隔3 d采用游標卡尺測量小鼠左右后足踝關節(jié)下0.5 mm 處的直徑值，作為關節(jié)腫脹度的指標。

2.4 細胞因子檢測 給藥50 d 后，采用毛細管眼球取血。離心收集血清（3 500 r／min、4 ℃、15 min），凍存于-80 ℃待測。以上樣品均采用ELISA 法檢測CRP、TNF-α 水平。

2.5 關節(jié)組織病理檢查 根據(jù)參考文獻［6］，給藥50 d后，頸椎脫臼處死小鼠，除去病變關節(jié)的皮毛和多余的組織，保留跖趾關節(jié)及趾間關節(jié)，4% 多聚甲醛固定，10%EDTA 脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。HE 染色，加封玻片保存，顯微鏡下觀察。

2.6 流式細胞術檢測Th1、Th2、Th17、Treg 淋巴細胞 給藥50 d 后，脫頸處死小鼠后置于75% 酒精中浸泡5 min殺菌，開腹，立即取出脾臟，研磨，分離脾淋巴細胞，加入1 mL 紅細胞裂解液，輕彈，室溫下靜置5 min，1 000g離心5 min，將制備的脾臟單細胞懸浮于RPMI 1640 （含10%熱滅活FBS），細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106／mL。分別取200 μL 細胞加入到96 孔細胞培養(yǎng)板中。加入250×的PMA＆離子霉素工作液0.8 μL，混勻。37 ℃孵育1 h，加入高爾基阻斷劑0.13 μL，繼續(xù)孵育6 h，期間混勻3 次。收集細胞于流式管中，加入相應抗體，上機檢測。

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時兩兩比較采用Tamhane’s T2 法。以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠踝關節(jié)一般狀態(tài) 經(jīng)完全弗氏佐劑和雞Ⅱ型膠原誘導后第3 天，造模小鼠開始出現(xiàn)關節(jié)及足趾輕微腫脹，食欲減退，精神差，體質(zhì)量下降情況；在第15 天進行2 次免疫后關節(jié)腫脹程度加重，行動不便。

3.2 各組小鼠踝關節(jié)腫脹度 如圖1 所示，與空白組相比，模型組、甲氨蝶呤組、通迪膠囊組小鼠自注射雞Ⅱ型膠原蛋白后，左右足關節(jié)明顯出現(xiàn)腫脹，并在第18 天達到高峰。經(jīng)給藥后，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的小鼠，左右足的腫脹度下降。

圖1 各組小鼠踝關節(jié)腫脹度

3.3 各組小鼠細胞因子水平 如圖2～3 所示，與空白組比較，模型組CRP、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的CRP、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。通迪膠囊與甲氨蝶呤組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠CRP 水平

圖3 各組小鼠血清因子TNF-α 水平

3.4 各組小鼠踝關節(jié)HE 染色 如圖4 所示，空白組各關節(jié)結(jié)構(gòu)較清晰正常，關節(jié)腔內(nèi)干凈，關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，滑膜未見增生，組織未見明顯炎癥反應。模型組局部關節(jié)可見滑膜增生、骨膜增生，并伴有少量炎癥細胞浸潤；關節(jié)腔內(nèi)可見較多細胞結(jié)構(gòu)；組織中還可見多處大量結(jié)締組織增生，并伴有少量炎癥細胞浸潤。甲氨蝶呤組組織中關節(jié)滑膜未見增生，關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關節(jié)腔內(nèi)干凈；組織中可見較多結(jié)締組織增生，但未見明顯炎癥反應；通迪膠囊組的組織中關節(jié)滑膜未見增生，關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關節(jié)腔內(nèi)干凈；組織可見較多結(jié)締組織增生（與甲氨蝶呤組相似），并伴有少量炎癥細胞浸潤。與空白組比較，模型組病變顯著，主要病變?yōu)榛ぴ錾⒔Y(jié)締組織增生、炎癥細胞浸潤；與模型組比較，甲氨蝶呤組和通迪膠囊組關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，關節(jié)腔內(nèi)干凈，未見滑膜增生，其中甲氨蝶呤組炎癥反應較模型組輕，通迪膠囊組炎癥反應較模型組差異不顯著，但癥狀較模型組稍好轉(zhuǎn)，提示通迪膠囊可減輕小鼠關節(jié)損傷。

3.5 各組小鼠Th1、Th2、Th17 和Treg 淋巴細胞比例 與空白組比較，模型組Th1、TH17 細胞比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的Th1、TH17 細胞比例降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組TH2、Treg 細胞比例減少（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組和通迪膠囊組的Th2、Treg 細胞比例升高（P＜0.05）。見圖5～6。

圖4 各組踝關節(jié)病理切片（200×）

圖5 流式細胞圖

與空白組比較，模型組的小鼠脾臟Th 細胞亞群相對數(shù)量Th1／Th2、Th17／Treg 比值均上升（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、通迪膠囊組的小鼠脾臟Th 細胞亞群相對數(shù)量Th1／Th2、Th17／Treg 比值均下降（P＜0.05）。見圖7。

4 討論

RA 是由自身免疫耐受失衡引起的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以滑膜炎癥、血管翳形成及關節(jié)破壞為主要病理特征。RA 確切發(fā)病機制不明，目前認為Th 亞型 （Th1、Th2、Th17、Treg） 間的相互作用及平衡在RA 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［7］。當平衡向Th1 和Th17 型細胞傾斜時，導致Th1 和Th17 型細胞因子，如TNF-α、IL-17 等炎性細胞因子亢進，而Th2 和Treg 型抗炎細胞因子如IL-4 和TGF-β 產(chǎn)生不足，機體內(nèi)穩(wěn)定的免疫內(nèi)環(huán)境遭到破壞，引起局部或全身免疫應答失常，導致RA 的疾病進展，由此可見RA 的轉(zhuǎn)歸依賴于Th 細胞亞型及其相關細胞因子的變化［8］。研究表明，Th17 細胞產(chǎn)生具有強大致炎效應的IL-17、TNF-α，通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 和破骨細胞的生成，促進關節(jié)滑膜的炎癥反應及軟骨破壞［9］；而Treg 細胞可以產(chǎn)生抑制性細胞因子IL-10、TGF-β、IL-35，并通過上調(diào)抑制性免疫細胞表面分子表達和下調(diào)活化T 細胞的相關基因，抑制靶細胞誘導的免疫應答［10］。Treg、Th17 細胞在特定的細胞因子微環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)換，初始CD4+T 細胞在TGF-β單獨作用下分化為Treg 細胞，而當TGF-β 和IL-6 共同存在時，能夠誘導RORγt 的表達，促進初始T 細胞分化為Th17細胞［11］。因此，調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 和Treg 細胞間的平衡可成為治療RA 的新方法。

本研究采用雞Ⅱ型膠原誘導BALB／c 小鼠關節(jié)炎模型，在發(fā)病機制、疾病癥狀和病理特征上與RA 都具有共同點，是研究人類RA 較為經(jīng)典、成熟的實驗動物模型，在國際上廣泛應用于治療RA 藥效評價和作用機制的研究［12］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)通迪膠囊干預后的CIA 小鼠關節(jié)腫脹度明顯降低，提示了該藥的抗炎效果。CIA 小鼠模型與人RA 相似，細胞免疫和體液免疫變化明顯，可表達TNF-α、CRP 等促炎細胞因子，ELISA 結(jié)果表明通迪膠囊能夠顯著的降低CRP 和TNF-α 血清因子水平，進一步證明了通迪膠囊的抗炎作用。病理切片的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，雖然在通迪膠囊給藥組的CIA 小鼠踝關節(jié)組織內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤，但較模型組輕，重要的是組織細胞排列相對整齊，血管翳生成減少，關節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)正常，說明了通迪膠囊不僅具有炎癥抑制作用，更可以保護CIA 小鼠的關節(jié)軟骨，具有較好的骨保護作用。

RA 的骨質(zhì)破壞進程是該病致殘的主要原因，目前的西醫(yī)常規(guī)治療策略無法有效抑制RA 骨破壞進程，而新型藥物如生物模擬物對骨破壞是否具有有效抑制作用仍有待進一步的研究觀察［13］。本研究中，通迪膠囊對CIA 小鼠血管翳生成的抑制作用及對關節(jié)軟骨的保護作用提示了該藥作為RA 骨保護藥物的開發(fā)價值，是中藥復方治療作用的一個亮點，值得重視和深入挖掘。

為了進一步探討通迪膠囊治療關節(jié)炎的作用機制，本研究結(jié)合RA 的免疫學機制，進一步探索了通迪膠囊對CIA小鼠脾臟Th1、Th2、Th17 和Treg 淋巴細胞的影響。在Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎模型中Th1／Th2、Th17／Treg 細胞的比例及其分泌的細胞因子較空白實驗組明顯升高，表明在Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎形成中Th 處于高度活化狀態(tài)，這與RA的研究結(jié)果報道一致［14-15］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)通迪膠囊灌胃給藥能夠升高Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠Th2 和Treg 細胞的水平，同時下調(diào)Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的Th1 和Th17的水平，從而調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17、Treg 功能性細胞間的相互作用，誘導Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠產(chǎn)生免疫耐受。另一方面經(jīng)過給藥后Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的Th1／Th2 與Treg／Th17 細胞比例下降，提示通迪膠囊通過調(diào)控Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠脾臟Th1／Th2、Th17／Treg 細胞比例失衡，重新誘導Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的免疫平衡，從而達到治療疾病的目的。鑒于Th17 活化在其他自身免疫病中的重要作用，以及新上市的針對IL-17 的生物制劑在銀屑病關節(jié)炎和強直性脊柱炎治療中的顯著療效［16-17］，通迪膠囊在其他自身免疫病治療中的應用價值值得進一步探討。

綜上所述，本研究表明通迪膠囊對Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎小鼠的抗炎和骨保護作用，并探討了其免疫學的機制與調(diào)控Th1／Th2、Th17／Treg 失衡有關。研究結(jié)果進一步提示了通迪膠囊對自身免疫病的治療作用，值得深入開展機制研究和臨床觀察。