骨質(zhì)疏松動物骨組織及血清檸檬酸含量變化的研究

王業(yè)楊 陳洪棟 王明森 黃偉斌 秦育濱 李煥彬 徐汪洋 周治來 張輝*

1. 廣東省第二人民醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510317 2. 廣東省第二人民醫(yī)院普外一科，廣東 廣州 510317 3. 普寧市中醫(yī)醫(yī)院骨科，廣東 普寧 515300 4. 普寧市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 普寧 515300

1941年，Dickens等首次發(fā)現(xiàn)骨組織含有較高濃度的檸檬酸[1]，隨后的很多報(bào)道證實(shí)骨組織與檸檬酸的關(guān)系[2-3]。骨組織中(及牙質(zhì))檸檬酸含量約為20～100 μmol/g。相對于軟組織來講，即為約5～25 μmol/g骨濕重。而一般軟組織中僅含有0.1～0.5 μmol/g(濕重)檸檬酸。因此，骨組織中檸檬酸的含量約是軟骨組織的10～20倍(前列腺組織例外)[3-5]。檸檬酸占骨總成分的1.6%左右，骨有機(jī)成分的5%，機(jī)體80%的檸檬酸存在于骨組織中[6-7]。這些信息提示我們檸檬酸是骨組織不可或缺的成分，在正常骨發(fā)育及骨維持中應(yīng)該有非常重要的功能/結(jié)構(gòu)作用。由年齡增長或激素缺失引發(fā)的骨量丟失是原發(fā)性骨質(zhì)疏松的主要病因。骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降，致使骨折在骨質(zhì)疏松患者中尤其常見，特別是老年人及絕經(jīng)后女性[8-9]。基于檸檬酸在骨結(jié)構(gòu)及功能中作用的研究，本研究擬對骨質(zhì)疏松動物模型中骨組織與血清檸檬酸水平變化進(jìn)行檢測，對這些問題的深入探討對揭示檸檬酸在骨質(zhì)疏松及早發(fā)現(xiàn)及預(yù)防中有重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

造模所用小/大鼠均購買于南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。動物飼養(yǎng)房：溫度(22±1)℃，濕度59%～61%，每天光照與黑暗時(shí)間各12 h，普通飲食，自由進(jìn)水。動物實(shí)驗(yàn)符合南方醫(yī)科大學(xué)動物委員會倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

檸檬酸檢測試劑盒，去蛋白質(zhì)試劑盒購自Biovision，TRAP染色試劑盒、維甲酸(retinoic acid)購自Sigma，血清生化分析試劑片購自北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司。骨鈣素抗體購自Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1骨質(zhì)疏松動物模型的構(gòu)建

激素缺失誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建[10]：SPF級Balb/c小鼠，健康，雌性未孕，4～6周，體重為18～20 g。實(shí)驗(yàn)分為兩組：正常對照組(Sham組)，手術(shù)模型組(OVX組)。小鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥，腹部脫毛。在無菌條件下于腹股溝水平沿腹中線剪開皮膚及肌層，暴露腹腔。手術(shù)組分離子宮并摘除卵巢。對照組僅摘除卵巢周圍1 g左右脂肪組織，而保留卵巢，其余操作均與手術(shù)組相同。清理傷口、縫合皮膚及基層，待小鼠清醒后，將其放回潔凈籠具后放回飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月，定期觀察小鼠狀態(tài)及死亡情況，每周測量體重。

小鼠老年骨質(zhì)疏松模型建立：實(shí)驗(yàn)組小鼠為健康Balb/c雄鼠，自然飼養(yǎng)至20月齡(aged)。對照組小鼠選用6月齡 Balb/c雄鼠(adult)。

維甲酸(RA)誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立[11]：清潔級SD大鼠，3.5月齡(200～250 g)，健康，20只，雌雄各半。隨機(jī)分為模型組和對照組，每組各10只，雌雄各半。維甲酸組(RA)大鼠每天給予維甲酸灌胃，持續(xù)灌胃14 d(70 mg/kg)。維甲酸溶液使用5%的硝酸纖維素鈉配置。對照組給予5%硝酸纖維素鈉的灌胃處理14 d(CON)。每周測一次體重變化。

1.2.2實(shí)驗(yàn)小鼠標(biāo)本的收集和骨參數(shù)檢測

各組小鼠在取材前一天使用micro CT活體檢測骨組織參數(shù)、骨密度[12]。將各組小鼠/大鼠麻醉，稱重，心臟穿刺采血。全血于室溫靜置2 h后，于6 000 r/min離心10 min，收集上層血清，保存至-80 ℃，備用。取小鼠下肢(股骨和脛骨)，分別進(jìn)行檸檬酸水平檢測與骨組織石蠟切片制備。用于檸檬酸水平檢測時(shí)，盡量剔除肌肉及筋膜組織，PBS沖洗3次，去除骨髓。將骨浸泡于氯仿：乙醇(1∶1)混合物中1 h，除去多余脂肪組織。去肉及去脂肪的骨組織樣本于液氮研磨成粉末。取50 mg骨組織粉末加入2 mL HCl(1.0 mol/L)，60 ℃水浴1 h。這一步驟可以溶解骨組織中的羥磷灰石(HA)，使檸檬酸釋放至溶液中。逐滴加入KOH(0.5 mol/L)使上述溶液pH=5。1 200g離心5 min，使膠原蛋白沉淀在離心管底部。上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，進(jìn)行檸檬酸水平測定或者4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于切片制備時(shí)，簡單剔出肌肉組織，保持關(guān)節(jié)完整，于4%多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行后續(xù)脫鈣，包埋等。

1.2.3血清生化分析

血清生化分析使用Catalyst Dx?化學(xué)分析儀完成。血清中堿性磷酸酶(ALKP)、磷酸鹽(PHOS)、鈣(Ca)、鈉(Na)、鉀(K)以及氯(Cl)的含量使用相應(yīng)的試劑片按照廠家說明進(jìn)行檢測。

1.2.4檸檬酸水平檢測

血清樣本由于蛋白質(zhì)含量較高，在進(jìn)行檸檬酸含量檢測前需要去除血清樣本蛋白質(zhì)。該操作使用去蛋白試劑盒，參照說明書進(jìn)行。去除蛋白質(zhì)的血清及骨組織檸檬酸水平檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.5蘇木素&伊紅(HE)染色

骨組織切片常規(guī)脫蠟水化后，蘇木素溶液染色1 min，流水沖洗5 min；切片浸入1%鹽酸酒精溶液分化10 s，流水沖洗至在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色為止；醇溶伊紅溶液染色2 min；常規(guī)步驟脫水透明、封片；于顯微鏡下觀察。

1.2.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)

根據(jù)試劑盒說明書配置TRAP染色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)及固定液，將固定液及適量去離子水置于37 ℃預(yù)熱。切片常規(guī)脫蠟水化后，固定液固定組織30 s，去離子水沖洗；將染色液滴于樣品上，并于37 ℃避光孵育1 h。染色完畢后，用去離子水沖洗。甲基綠復(fù)染30 s，去離子水沖洗，封片保存。于顯微鏡下觀察骨小梁表面粘附的破骨細(xì)胞數(shù)量變化。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色(IHC)

骨組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，去離子水洗3次，5 min/次。將切片置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液(pH=6.0)，于60 °C水浴過夜孵育(12 h)，進(jìn)行抗原修復(fù)。次日取出切片,自然冷卻至室溫。PBS洗3次，5 min/次。使用3% 過氧化氫溶液，室溫避光孵育10 min。PBS洗3次，5 min/次。滴加5%正常山羊血清于37 ℃敷箱孵育1 h。甩去封閉液，滴加骨鈣素一抗溶液(1∶100)，于4 ℃過夜孵育。PBS洗3次，5 min/次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，5 min/次。滴加現(xiàn)配的DAB顯色液，于顯微鏡下觀察染色狀態(tài)，及時(shí)終止。自來水沖洗5 min。蘇木素染液染色1 min。1%鹽酸酒精分化10 s，水洗5 min。常規(guī)脫水透明，用中性樹脂封片后觀察骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)量變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1雌激素缺失誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠骨組織中檸檬酸水平下降

6周齡小鼠在去卵巢手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月(OVX組)，子宮由于雌激素的缺失嚴(yán)重萎縮(圖1 A)，與對照組相比(Sham組)，體重顯著升高(圖1B)。micro-CT對股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描分析，顯示OVX組骨密度顯著降低，骨小梁數(shù)量及厚度均顯著減少，骨小梁分離度顯著增加，BV/TV顯著減少，皮質(zhì)骨的內(nèi)外徑大小也顯著降低(P<0.05，圖1C-D)，說明激素水平下降引起的骨質(zhì)疏松小鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 去卵巢骨質(zhì)疏松模型小鼠的構(gòu)建成功注：A 6周齡雌性小鼠去卵巢手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)，3個(gè)月后，去卵巢小鼠子宮出現(xiàn)萎縮；B體重顯著增加； C 去卵巢小鼠的BV/TV，骨小梁數(shù)量，骨小梁厚度，皮質(zhì)骨的厚度等均顯著下降，而骨小梁分離度顯著增加；D micro-CT二維重建股骨遠(yuǎn)端圖片。與對照組相比，*P<0.05。Fig.1 Ovariectomy (OVX) mice showed phenotypes of osteoporosis

對OVX組及Sham組小鼠下肢骨組織切片進(jìn)行染色，HE染色結(jié)果顯示OVX組小鼠骨髓腔中脂滴數(shù)量增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。而骨小梁數(shù)量顯著減少，與micro CT結(jié)果一致(圖2 A)。TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞以及OCN染色陽性的成骨細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，說明OVX組小鼠呈現(xiàn)明顯增加的骨吸收及骨形成(圖2B-C)。

圖2 去卵巢小鼠骨小梁表面成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞數(shù)量均增加注：A HE結(jié)果顯示OVX小鼠骨小梁減少，骨髓腔脂滴增多； B TRAP結(jié)果顯示OVX小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多； C IHC結(jié)果顯示OVX小鼠OCN陽性的成骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加。與對照組比較，*P<0.05；紅色箭頭 破骨/成骨細(xì)胞；N.TRAP+/ N.OCN+ 骨小梁表面破骨/成骨細(xì)胞數(shù)量。Fig.2 The number of osteoblasts and osteoclasts on trabecular surface of OXV mice significantly increased

上述結(jié)果結(jié)合OVX小鼠及對照小鼠骨密度差異(圖3 A)，確定OVX小鼠骨質(zhì)疏松模型成功建立。隨后對兩組小鼠下肢骨組織中檸檬酸水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與Sham組相比，OVX組小鼠每克骨組織中檸檬酸的水平顯著降低(圖3B，P<0.05)。

圖3 去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠骨組織中檸檬酸水平下降注：A 小鼠去卵巢3個(gè)月后，骨密度顯著下降；B OVX小鼠骨組織檸檬酸含量顯著低于對照小鼠，*P<0.05。Fig.3 OVX mice showed significantly reduced citric acid content in bone tissue

2.2藥物誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中檸檬酸水平下降

使用維甲酸灌胃的方法構(gòu)建了藥物誘導(dǎo)的SD大鼠骨質(zhì)疏松模型。micro-CT分析結(jié)果顯示，維甲酸灌胃14 d后，大鼠股骨及脛骨皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的骨密度相比對照組顯著降低，大鼠出現(xiàn)明顯骨量丟失(圖4 A)。這些骨量丟失大鼠每克骨組織中檸檬酸的水平相比對照組也顯著減少(圖4B)。

圖4 維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中檸檬酸水平均顯著降低注：A 3.5月齡SD大鼠，維甲酸灌胃14 d，維甲酸組(RA)比對照組(CON)骨密度顯著下降；B RA組骨中檸檬酸水平顯著低于CON組，*P<0.05。Fig.4 Citric acid content in bone is reduced in retinoic acid (RA)-induced osteoporotic rats

2.3老年骨質(zhì)疏松小鼠骨組織中檸檬酸水平下降

Micro CT分析結(jié)果顯示與6月齡成年健康小鼠相比，20月齡的自然衰老組小鼠骨密度顯著降低，骨小梁基本消失，骨小梁分離度顯著增加，BV/TV顯著減少，皮質(zhì)骨的內(nèi)外徑大小也顯著降低(P<0.05，圖5 A-B)。HE染色結(jié)果與μCT 二維重建結(jié)果一致，老年鼠骨小梁基本消失(圖5C)。老年小鼠TRAP染色陽性破骨細(xì)胞數(shù)量(圖5D)及OCN染色陽性成骨細(xì)胞(圖5E)的數(shù)量均顯著低于年輕小鼠，說明老年小鼠的骨形成和骨吸收能力均下降。

圖5 20月齡老年小鼠出現(xiàn)增齡性骨質(zhì)疏松注：A 自然衰老的20月齡與6月齡年輕小鼠的下肢骨的骨參數(shù)變化；B micro CT二維重建老年小鼠與年輕小鼠的股骨遠(yuǎn)端比較； C 骨組織切片HE染色檢測破骨細(xì)胞數(shù)量(紅色箭頭)； D 骨組織切片TRAP染色檢測破骨細(xì)胞數(shù)量(紅色箭頭)； E IHC染色檢測OCN陽性成骨細(xì)胞數(shù)量(紅色箭頭)。N.TRAP+/N.OCN+：骨小梁表面破骨/成骨細(xì)胞數(shù)量，*P<0.05。Fig.5 Aged mice (20 months old) showed significant osteoporosis

與OVX骨質(zhì)疏松小鼠及RA骨質(zhì)疏松大鼠結(jié)果類似，單位重量老年骨質(zhì)疏松鼠骨組織中檸檬酸水平也明顯低于正常對照小鼠，說明骨中檸檬酸水平隨著增齡性骨量丟失的發(fā)生而下降(圖6)。

圖6 老年骨質(zhì)疏松鼠骨組織中檸檬酸含量顯著降低注：A 自然衰老的20月齡老年鼠及6月齡健康成年鼠下肢骨使用microCT測量骨密度；B 老年鼠單位重量骨組織中檸檬酸含量較年輕鼠顯著降低；*P<0.05。Fig.6 Citric acid content in aged mice was significantly reduced compared with adult mice

2.4骨質(zhì)疏松小鼠及大鼠血漿中檸檬酸水平顯著下降

與Sham組相比，OVX組小鼠血清中Ca、Na、K、Cl及 Phos水平?jīng)]有明顯變化，而 ALKP水平顯著升高。與Sham組相比，同樣體積的OVX小鼠血清中檸檬酸水平顯著降低。而老年骨質(zhì)疏松小鼠及RA骨質(zhì)疏松大鼠血清中檸檬酸水平均顯著低于相應(yīng)的對照組。這些結(jié)果表明骨質(zhì)疏松的大/小鼠血清檸檬酸水平也下降(圖7)。

圖7 骨質(zhì)疏松的小鼠/大鼠血清檸檬酸水平均下降注：A OVX骨質(zhì)疏松小鼠血清生化分析；B 老年小鼠血清生化分析；C 維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠血清生化分析。B、D、F 骨質(zhì)疏松大/小鼠單位體積血清中檸檬酸水平顯著低于對照組，*P<0.05。Fig.7 Serum citric acid concentration of osteoporotic mice and rats was decreased compared to controls

3 討論

雖然檸檬酸在骨組織中含量很高這一觀點(diǎn)早已提出[1,3,13]，但骨中檸檬酸的來源及檸檬酸在骨發(fā)育、維持及骨病理性疾病中的作用尚沒有明確報(bào)道。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)生骨質(zhì)疏松的骨組織中，檸檬酸水平顯著下降。在發(fā)生骨量丟失的動物模型中，檸檬酸水平顯著低于正常組。本研究將骨中檸檬酸與骨質(zhì)疏松相聯(lián)系，提示骨中檸檬酸可能在維持血液循環(huán)檸檬酸穩(wěn)態(tài)中有重要作用。血清檸檬酸水平變化可能是年齡相關(guān)或激素缺失誘導(dǎo)的骨量丟失的一個(gè)標(biāo)志。

骨強(qiáng)度由骨組織的兩個(gè)特性決定：骨組織成分和骨結(jié)構(gòu)(骨強(qiáng)度和骨質(zhì)量)[14-16]。自1941年Dickens首次報(bào)道骨中高水平的檸檬酸，骨中檸檬酸的作用已經(jīng)吸引了大量研究者的關(guān)注[2,17-18]。但由于研究方法及技術(shù)的限制，在很長一段時(shí)間，對骨中檸檬酸的研究相對較為停滯。直至Schmidt-Rohr及其團(tuán)隊(duì)使用多核磁共振(NMR)及距離測量分析了骨微結(jié)構(gòu)表面的檸檬酸[7]。作為羥基磷灰石-膠原蛋白復(fù)合物的約束連接成分，檸檬酸占骨組織有機(jī)成分濕重的5.5%。Davies等[19]提出骨中檸檬酸參與形成骨的結(jié)構(gòu)，水化層的檸檬酸在礦化片層之間形成橋梁，這一結(jié)構(gòu)能合理解釋一些已知的骨礦物結(jié)構(gòu)特征。因此，骨中的檸檬酸不是增加鈣溶解度的溶劑，而是磷灰石納米晶體的一個(gè)強(qiáng)有力的結(jié)合成分，檸檬酸的結(jié)合賦予骨組織重要的生物力學(xué)性能和界面相容性，如骨穩(wěn)定性，強(qiáng)度和抗骨折能力[3,20]。

在本研究中，我們成功構(gòu)建了不同的骨質(zhì)疏松大/小鼠模型，包括增齡性骨質(zhì)疏松小鼠模型，維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型及激素缺失誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型，而發(fā)生骨質(zhì)疏松的骨組織中檸檬酸水平均下降。骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)，骨形成(成骨細(xì)胞)與骨吸收(破骨細(xì)胞)之間的平衡被打破，同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化發(fā)生變化，而更有利于脂肪細(xì)胞的分化[21]。一方面，骨形成與骨吸收之間的失衡可能會減少成骨細(xì)胞檸檬酸的合成，另一方面，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化可能需要更多的檸檬酸作為細(xì)胞乙酰輔酶的來源用于脂肪酸的生物合成。這些與骨質(zhì)疏松相關(guān)的病理?xiàng)l件可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松骨中檸檬酸的產(chǎn)生下降，使參與骨結(jié)構(gòu)的檸檬酸減少。骨質(zhì)疏松性骨礦物的結(jié)晶度和生物力學(xué)性質(zhì)也因此發(fā)生變化[20]，降低了骨強(qiáng)度和骨質(zhì)量，使骨質(zhì)疏松人群易發(fā)脆性骨折。雖然骨質(zhì)疏松發(fā)生中檸檬酸不足的作用尚待進(jìn)一步探索研究，本研究顯示骨中檸檬酸不足或減少與骨質(zhì)疏松性有關(guān)。因此血清檸檬酸有可能是檢測骨量丟失相關(guān)疾病的標(biāo)志分子，如增齡性及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，為這些疾病的預(yù)防和早期診斷提供新的依據(jù)。