基于網絡藥理學探討骨碎補治療骨質疏松癥的作用機制

馬江濤 萬雷 黃宏興*

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510375

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨骼疾病，其特點是骨量降低，骨組織微結構破壞，從而導致骨脆性增加，骨折風險增加。隨著人口老齡化以及糖皮質激素的廣泛應用，骨質疏松癥在很大程度上已成為“隱形殺手”。預計到2050年[1]，全世界60歲及以上的老年人數將達到20億。到那時，骨質疏松癥的發病率也會迅猛增加，這將成為沉重的社會經濟負擔。目前，OP的治療[2]主要包括補充骨健康基本補充劑(鈣劑、維生素D)，骨吸收抑制劑(雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素、選擇性雌激素受體調節劑等)，骨形成促進劑(甲狀旁腺素類似物)，活性維生素D及其類似物等。但這些西藥普遍存在不良反應眾多、價格高昂等問題，這嚴重限制了西藥在臨床上的廣泛應用。因此，迫切需要尋求高效、安全、價廉的抗骨質疏松新藥。

近年來，多項研究[3]表明中藥影響骨質疏松癥的骨代謝，調節人體骨代謝相關細胞因子及信號通路，促進成骨細胞合成，抑制骨量丟失，明顯改善患者骨質疏松癥狀。其中，補腎助陽、活血化瘀類中藥，如淫羊藿、杜仲、續斷、補骨脂、骨碎補等，對骨質疏松癥的治療效果顯著。骨碎補[4]，為槲蕨的干燥根莖，性溫、味苦，歸肝、腎經，具有活血止痛，補腎強骨的功效，能通血脈、續筋骨、療傷痛，為傷科要藥。本品含柚皮苷、骨碎補雙氫黃酮苷、骨碎補酸等成分，能促進對鈣的吸收，提高血鈣和血磷水平，有利于骨鈣化和骨質的形成。除了抗骨質疏松的作用外，骨碎補具有不良反應少，價格低廉等優點。因此，研究骨碎補中有效成分治療骨質疏松癥的作用機制具有重要的理論價值。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對生物系統的網絡分析，選取特定的信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科。中藥網絡藥理學基于多學科交叉，整合中藥、中藥有效成分、中藥靶標、疾病靶標、信號通路等信息，利用靶標的一致性進行大數據分析，得出中藥-疾病靶標并進行相關通路分析，這為科學研究中藥復方的作用機制提供了技術支持，也為中醫藥研究的現代化指明了方向。因此，本研究基于中藥網絡藥理學的相關原理及軟件，探索并構建單味中藥骨碎補治療OP的作用機制網絡，為進一步研究骨碎補的作用機制及新藥開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1資料

本研究使用的數據庫及相關分析平臺見表1。

1.2方法

1.2.1骨碎補中有效成分的篩選和靶點預測

本研究通過檢索中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，對骨碎補的所有有效成分進行初步篩選，其中篩選條件[5]為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%，藥物類藥性(drug likeness，DL)>0.18，見表2。采用TCMSP靶點預測模型和Perl軟件對相關有效成分作用靶點進行預測。

1.2.2骨碎補靶點基因名(gene symbol)的添加

利用Perl軟件和UniProt知識庫為篩選出的靶點基因添加基因名，由于某些靶點可能在UniProt知識庫中找不到對應的基因名，無法找到基因名的靶點刪除，故實際得到的靶點基因名要少。

1.2.3已知OP相關疾病靶點基因的獲取

利用“osteoporosis”作為關鍵詞，對GeneCards數據庫、OMIM數據庫進行已知疾病靶點基因的檢索及篩選，并刪除檢索結果中重復的靶點基因，得到疾病靶點基因。

1.2.4中藥靶點基因和疾病靶點基因的交集

利用R語言軟件將疾病靶點基因與中藥靶點基因取交集，得到中藥-疾病共同靶點基因的韋恩圖(見圖1)，從中得到中藥-疾病共同靶點基因。

1.2.5中藥-疾病調控網絡的構建

將中藥靶點基因和中藥-疾病共同靶點基因利用Perl軟件進行一一映射，然后利用Cytoscape軟件進行計算，得到中藥-疾病調控網絡(見圖2)。其中節點的類型有疾病、中藥、中藥靶點基因和中藥-疾病共同靶點基因。

1.2.6骨碎補治療OP的靶點基因蛋白相互作用網絡構建與核心靶點基因的篩選

利用STRING在線軟件將中藥-疾病共同靶點基因輸入軟件，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分數值為0.7，保存相應結果文件(見圖3)。將所得文件輸入R語言計算，得到蛋白互作網絡核心基因的條圖(見圖4)。

1.2.7GO和KEGG功能富集分析

將中藥-疾病共同靶點基因利用R語言軟件計算，得到GO功能富集分析(圖5a、5b)和KEGG功能富集分析(圖6a、6b)。以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1骨碎補有效成分及相關靶點篩選

通過對TCMSP數據庫中骨碎補所有已報道的有效成分及其相關靶點篩選，共搜索到有效成分71個，相關靶點587個。根據OB和DL參數對骨碎補的有效成分進行篩選，共獲得有效成分18個，有效成分對應的靶點304個。

表1 本研究使用的數據庫及相關分析平臺 Table 1 Databases and related analysis platforms used in this study

表2 通過TCMSP數據庫骨碎補所有成分根據OB和DL參數進行篩選后的結果Table 2 The results of screening all ingredients of Rhizoma Drynariae by OB and DL parameters in TCMSP database

2.2中藥靶點基因和疾病靶點基因的交集

利用R語言軟件將疾病靶點基因與中藥靶點基因取交集，得到中藥-疾病共同靶點基因的韋恩圖，從中得到中藥-疾病共同靶點基因98個。其中疾病靶點基因3 530個，中藥靶點基因148個。

圖1 中藥靶點基因和疾病靶點基因的交集Fig.1 The intersection of TCM target genes and disease target genes

2.3中藥-疾病調控網絡的構建

圖中紅色代表(菱形)骨質疏松癥，藍色(橢圓形)代表中藥骨碎補，綠色(箭頭形)代表骨碎補的有效成分，黃色(三角形)代表中藥-疾病共同靶點基因。中藥骨碎補主要通過10種有效成分作用于98個靶點基因，這98個靶點基因可能影響骨質疏松癥的發生。

圖2 中藥-疾病-靶標調控網絡Fig.2 The regulatory network of TCM-Disease-Target

2.4骨碎補治療OP的靶點基因蛋白相互作用網絡構建與核心靶點基因的篩選

根據文獻研究，篩選出骨碎補治療OP的核心靶點基因。其中，鄰接節點較多的4個靶標分別是：白介素-6基因(IL-6)、JUN基因、絲裂原活化蛋白激酶-1基因(MAPK-1)、表皮細胞生長因子基因(EGF)。

IL-6[6]是骨吸收的重要環節，其以自分泌和旁分泌形式作用于成骨細胞，促進自身合成，調節bax/bcl-2比值，抑制破骨細胞凋亡，促進成骨細胞凋亡，導致骨質疏松癥。原發性骨質疏松時骨組織中癌基因c-JUN表達增加，c-JUN表達增加與骨細胞和成骨細胞凋亡有關，c-JUN與原發性骨質疏松癥存在聯系[7]。MAPK是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，MAPK-1是MAPK的一個亞型，許多胞外信號通過MAPK信號通路，參與成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡，在骨質疏松的發生中具有重要作用[8]。體外實驗表明EGF促進破骨細胞骨吸收，抑制成骨細胞骨形成，參與骨質疏松[9]。

圖3 骨碎補治療OP的靶點基因蛋白互作網絡Fig.3 Target gene protein protein interaction (PPI) network of Rhizoma Drynariae for OP

圖4 蛋白互作網絡核心基因的條圖Fig.4 Barplot of PPI core genes注：左列為基因名，如IL-6(interleukin-6，白介素-6)，數字為相應基因鄰接節點數目，如IL-6鄰接節點數目為41。

2.5GO功能富集分析

骨碎補治療OP的核心靶點基因的GO功能富集分析結果見圖5a、5b。骨碎補治療OP的核心靶點基因的GO功能主要涉及血紅素結合、輔因子結合、細胞因子受體結合、四吡咯結合、類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、細胞因子活性、氧化還原酶活性、轉錄激活活性、受體配體活性等。

圖5a GO功能富集分析柱狀圖Fig.5a GO functional enrichment analysis barplot

圖5b GO功能富集分析氣泡圖Fig.5b GO functional enrichment analysis dotplot注：柱狀圖圖形左側字母為GO名稱，下面數字為基因的數目，柱狀圖形表示富集在GO上的基因，P代表富集的顯著性，顏色越紅，富集的程度越高，相應的P值越小。

氣泡圖圖形左側字母為GO名稱，下面數字為基因的比例，圓圈大小表示富集的基因的數目，顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，相應的P值越小。

2.6KEGG通路富集分析

骨碎補治療OP的核心靶點基因的KEGG通路富集分析結果見圖6a、6b，骨碎補治療OP的核心靶點基因的KEGG功能主要涉及：糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、Th17細胞分化信號通路等。富集程度相對低的信號通路有：NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、凋亡信號通路、MAPK信號通路、破骨細胞分化信號通路、T細胞受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、FoxO信號通路等。

圖6a KEGG功能富集分析柱狀圖Fig.6a KEGG functional enrichment analysis barplot

圖6b KEGG功能富集分析氣泡圖注：柱狀圖圖形左側字母為KEGG名稱，下面數字為基因的數目，柱狀圖形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的顯著性，顏色越紅，富集的程度越高，相應的P值越小。Fig.6b KEGG functional enrichment analysis dotplot

綜合有關骨質疏松信號通路的文獻，研究發現糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、Th17細胞分化信號通路、NF-κB信號通路、凋亡信號通路、MAPK信號通路、破骨細胞分化信號通路、PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、FoxO信號通路等均參與骨質疏松的發病。

氣泡圖圖形左側字母為KEGG名稱，下面數字為基因的比例，圓圈大小表示富集的基因的數目，顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，相應的P值越小。

3 討論

基于中醫藥“整體觀念”和網絡藥理學“系統生物學”的理論，中藥網絡藥理學通過TCMSP分析平臺等軟件，構建“中藥-有效成分-靶標-疾病”網絡，全面分析整合中藥多種有效成分作用于疾病的靶標，深入研究中藥-疾病核心靶標的作用機制，為研究中藥的作用機制及中藥新藥開發提供技術和理論支持。

本研究表明，骨碎補的主要有效成分可通過多個靶點基因、多個信號通路影響OP的發生。骨碎補治療OP的核心靶點基因主要有IL-6基因、JUN基因、MAPK-1基因、EGF基因等，這些基因可通過介導骨吸收和骨形成來調控骨質疏松的發生。骨碎補治療OP的核心靶點基因的KEGG通路眾多，這些通路主要包括糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、Th17細胞分化信號通路等。柳辰玥[10]研究發現桑葉水提液可能通過抑制糖尿病性骨質疏松癥患者股骨和脛骨中AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信號通路中相關蛋白的表達，減輕氧化應激損傷來防治糖尿病性骨質疏松。陳鵬等[11]發現絕經后骨質疏松癥中TNF-α通過激活NF-κB來促進RANKL誘導的破骨細胞形成。張國權等[12]通過體外培養大鼠成骨細胞，發現IL-17通過上調cathepsin K、MMP9的表達量，從而增強破骨細胞降解骨基質的能力。鐘航等[13]通過動物實驗發現HIF-1信號通路參與了小鼠絕經后骨質疏松癥(PMOP)的病理演變過程，抑制HIF-1信號通路可改善PMOP的嚴重程度。李春亮等[14]通過臨床研究發現骨質疏松合并壓縮性骨折患者Th17細胞功能的增強能夠影響骨代謝過程中的炎性反應及蛋白酶活性。這些富集度高的信號通路主要通過減輕氧化應激損傷、抑制破骨細胞形成、促進成骨細胞形成等作用發揮抗骨質疏松作用。骨碎補可能通過抑制糖尿病并發癥患者骨骼的AGE-RAGE信號通路中相關蛋白的表達，減輕氧化應激損傷來防治糖尿病性骨質疏松；可能通過TNF-α激活NF-κB來促進RANKL誘導的破骨細胞形成；可能通過IL-17上調cathepsin K、MMP9的表達量，從而增強破骨細胞降解骨基質的能力；可能通過抑制HIF-1信號通路改善PMOP的嚴重程度。

綜上所述，骨碎補治療OP的作用機制是通過骨碎補中多種活性成分調控OP相關的靶點基因，靶點基因進一步調控多種信號通路，最終在多種信號通路的綜合作用下，機體表現出相應的表型。這為發現新通路，調控富集程度高的信號通路來治療疾病以及全面認識中藥與疾病的關系提供了思路。中藥網絡藥理學開啟了探索中藥復方治療疾病作用機制的大門，必將促進中藥的現代化研究。