二仙湯防治骨質疏松癥的網絡藥理學研究

王明亮 閆小龍 田思勝

1. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355 2. 日照市中醫醫院，山東 日照 276800 3. 山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014

隨著世界人口老齡化程度的增高，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的發病率也在逐年上升[1]。中醫理論認為，腎藏精、主骨生髓，骨的生長發育有賴于腎中精氣的滋養與推動[2-3]，腎精不足則骨缺乏滋養。二仙湯是臨床上治療OP的經典名方[4]，其中仙茅、淫羊藿、巴戟天溫補腎陽，滋補腎精；佐以知母、黃柏滋補腎陰、瀉腎火；當歸養血活血，調理沖任為使藥[5]，全方補腎壯陽藥與滋陰瀉火藥并用，適合用于陰陽俱虛的復雜癥侯[6]。臨床和動物實驗均證實，二仙湯能有效防治OP，改善OP患者以及OP模型動物骨密度、骨小梁厚度[7-8]，提高體外培養的成骨細胞增殖能力和骨髓間充質干細胞的成骨轉化[9]。但是，中藥復方化學成分多、結構復雜以及有效成分不確定等因素的存在，使中藥復方作用機理的研究受到了限制，二仙湯治療OP的具體分子機制尚未清楚。網絡藥理學是在系統生物學與計算機技術基礎上通過網絡分析，系統綜合觀察藥物對疾病的干預與影響，與中醫學整體觀念理論相契合，能夠對中藥復方及方中化學成分進行系統分析[10-12]。本研究應用網絡藥理學方法，對中藥經典名方二仙湯治療OP的分子機制進行預測，為中藥復方治療機制的研究提供科學可靠的方法。

1 材料和方法

1.1二仙湯中活性成分篩選和靶點預測

中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, 版本2.3, http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)能分析所含化合物的藥物動力學(ADME：absorption，distribution，metabolism，excretion)的相關參數，包括口服吸收利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)、Caco-2細胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數等[13]。本研究分析二仙湯有效活性成分時，設定篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18；同時應用TCMSP預測活性成分的作用靶點[14]。

1.2二仙湯“活性成分-靶點網絡”的構建

將獲得的二仙湯活性成分、活性成分作用靶點導入Cytoscape(版本3.7.1，https://cytoscape.org/)軟件中，構建“活性成分-靶點網絡”，應用network analyzer計算網絡中節點參數以分析二仙湯中重要的成分和靶點。

1.3OP發病相關基因篩選

本研究以“Osteoporosis”為關鍵詞檢索網絡已知公共疾病靶點數據庫，包括TTD (Therapeutic Target Database，更新至2017.09.15, http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/); DrugBank 數據庫 (版本5.1.4, https://www.drugbank.ca/); OMIM數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man, https://www.omim.org/); GAD databases (Genetic Association Database,更新至2014.08.18, https://geneticassociationdb.nih.gov/)；PharmGKB數據庫(https://www.pharmgkb.org/); DisGeNET 數據庫 (版本6.0, http://www.disgenet.org/home/)，刪除各數據庫中重復靶點，獲得已知的OP發病靶點。

GEO數據庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個由基因表達數據、芯片和微陣列組成的公共功能基因組數據庫。以“Osteoporosis”為關鍵詞檢索GEO數據庫，篩選獲得GSE56116數據集，包含腎陰虛組樣品4個(GSM1356155，GSM1356157，GSM1356158，GSM1356161)，腎陽虛組樣本3個(GSM1356160，GSM1356163，GSM1356164)，非腎虛組樣本3個(GSM1356156，GSM1356162，GSM1356165)，對照組樣品3個(GSM1356159，GSM1356166，GSM1356167)。利用R語言 limma包分析芯片數據的差異基因，篩選條件設定為P值<0. 05，差異倍數(fold change，FC)>2。

1.4PPI網絡構建

構建蛋白質與蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡，有助于挖掘核心調控基因、深入了解疾病的發生和發展機制。本研究利用STRING數據庫(版本11.0，https://string-db.org/)[15]對PPI網絡進行預測，綜合得分大于0.4的交互作用被認為具有統計學意義。為進一步分析網絡中核心靶點，采用Cytoscape進行網絡拓撲分析，運用自由度(degree，DC)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)等指標進行篩選，其中DC值、BC值、CC值大于所有節點對應平均值的節點為網絡中的重要節點。

1.5關鍵作用靶點KEGG和GO富集分析

表 1 預測出靶點活性成分的基本信息Table 1 Basic informaiton for predicting target active components

注釋、可視化和集成發現數據庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID, 版本6.8, https://david.ncifcrf.gov/)[16]是一個在線生物信息數據庫，用于從高通量實驗技術生成的大規模分子數據集中了解高級功能[17]和注釋基因的生物學過程[18]。為了分析關鍵靶點的功能，采用DAVID數據庫進行功能富集分析。

2 結果

2.1二仙湯活性成分篩選與ADME分析

通過TCMSP數據庫篩選二仙湯中6味中藥入血的活性成分，其中仙茅7個，淫羊藿23個，當歸2個，巴戟天20個，黃柏27個，知母15個，刪除重復成分，得到84個活性成分。二仙湯各味中藥中符合篩選標準的成分比例圖，見圖1。

圖1 二仙湯活性成分ADME參數分布Fig.1 ADME parameter distribution of active components in Erxian decoction

2.2二仙湯“活性成分-靶點網絡”構建

應用Cytoscape構建二仙湯活性性成分和作用靶點網絡以尋找網絡中的關鍵節點，確定二仙湯有效成分中發揮重要作用的成分和靶點。結果如圖2和表1所示，構建的網絡中，共有84個活性成分，21個活性成分采用TCMSP預測出145個作用靶點。

圖2 中藥-活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Traditional Chinese Medicine-active component-target network diagram

紅色菱形代表中藥，綠色倒三角代表預測出靶點的活性成分，綠色正方形代表未預測出靶點的活性成分，藍色圓形代表作用靶點，圓形大小代表degree值的大小，圓形越大表示degree值越大

2.3OP相關致病靶點

疾病相關數據庫中GAD、TTD、OMIM、DrugBank、PharmGKB和DisGeNET分別檢索到275、27、94、48、5和426個靶點，去除重復項，共納入691個與OP發生發展相關的已知靶點。

圖3 基于GSE56116芯片OP致病靶點的聚類圖和火山圖Fig.3 Clustering map and volcano map of OP pathogenic targets based on GSE56116 chip

利用limma包分析GEO芯片數據庫中GSE56116數據集，共找出84個變化最為明顯的基因，其中上調表達的有70個，下調表達的有14個，這些基因可能與OP致病密切相關。差異表達基因見聚類圖(圖3 A)和火山圖(圖3B)所示。

2.4PPI網絡的構建

通過二仙湯活性成分作用靶點與OP致病靶點直接映射，獲得關鍵作用靶點40個，如圖4所示。采用String構建關鍵靶點的PPI網絡，結果如圖5所示，共有40個節點，278個相互作用關系。通過DC值、BC值和CC值進行網絡拓撲篩選，獲得核心節點9個，見表2。

表2 二仙湯治療OP核心靶點的基本信息Table 2 Basic information of Erxian decoction in treating OP core targets

圖4 OP關鍵靶點的篩選圖Fig.4 Screening of OP key targets

圖5 關鍵靶點蛋白質相互作用網絡Fig.5 Key target protein interaction network

圖5中，節點的大小代表節點的自由度(degree)，節點越大表示degree值越大；線條表示各個靶點間的相互作用關系，條線粗細表示相互作用關系的緊密程度，線條越粗表示相互作用越緊密。

2.5關鍵靶點的KEGG和GO富集分析

應用DAVID對上述關鍵基因進行功能富集分析。GO分析結果表明，關鍵基因富集的生物學過程變化在RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調節作用(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、一氧化氮生物合成過程的正調控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、序列特異性結合轉錄因子活性的正調控(positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity)等，見圖6 A。關鍵基因富集細胞組分主要為細胞外間隙，胞外區，核漿和質膜等，見圖6B。分子功能主要富集在酶結合(enzyme binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、甾體結合(steroid binding)，見圖6C。KEGG通路分析結果所示，關鍵靶點涉及的非疾病命名信號通路主要富集在TNF信號通路(TNF signaling pathway)，低氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)，雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)，血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等通路過程，見圖6D和表3。

圖6 關鍵靶點的富集分析圖注：A 生物學進程，B 細胞組分，C 分子功能，D KEGG信號通路。Fig.6 Enrichment analysis plot of key targets

KEGG分析結果如表3所示，TNF信號通路富集基因數目及P值均較為顯著，分析其可能為二仙湯治療OP的重要途徑。其具體作用機制可能是通過調控細胞凋亡、炎癥活動、細胞外基質重塑、細胞粘附和細胞存活等過程，發揮治療OP的作用，見圖7。

表3 OP相關基因的KEGG分析Table 3 KEGG analysis of OP-related genes

圖7 TNF信號通路中富集基因具體作用機制圖Fig.7 Specific mechanism of enriched genes in TNF signaling pathway

3 討論

由于全球人口老齡化，估計OP的發病率將在未來20年翻一番，給公共衛生服務造成沉重的負擔[19]。目前西藥治療OP療效顯著[20]，但是藥物治療的不良反應和長期依從性差的問題未得到有效解決[21]。中草藥治療骨病已有幾千年的歷史，具有不良反應少，療效顯著的特點，受到越來越多的應用[22]，但是具體的分子機制尚未清楚。

本研究基于網絡藥理學的方法，從TCMSP數據庫中篩選出二仙湯的活性成分及作用靶點，檢索OP的致病靶點，構建PPI網絡并映射核心靶點，進行核心靶點的KEGG分析和GO富集分析，結果顯示，TNF信號通路、低氧因子誘導因子1信號通路和雌激素受體信號通路可能為二仙湯治療OP的關鍵途徑。

骨髓間充質干細胞是一種成體干細胞，具有與其他組織相同的遺傳基礎[23]，BMSCs的增殖和分化是成骨的關鍵[24]。炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)和干擾素-γ(IFN-γ)也可影響骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化[25]。TNF-α是一種重要的炎癥細胞因子，通過激活多種信號通路和分子，調節細胞的增殖、分化和凋亡[26]。Lu等[27]證明，由于轉錄因子核因子κ-α(NF-κB)的激活，TNF-α抑制了成骨細胞與前體細胞的分化，降低了RUNX 2和成骨細胞相關轉錄因子(Osterix)的表達，抑制了維生素D刺激的轉錄。Hess等[28]研究表明，TNF-α通過NF-κB信號通路促進BMSCs中BMP-2的表達，從而促進細胞外基質的礦物質化。

缺氧對多種組織和細胞類型的影響主要由HIF-1介導[29]，其中HIF-1α在骨發育和再生過程中起著重要作用。HIF-1α通路是適應低氧反應的中樞調節因子，這一途徑調控血管生成基因如VEGF、血管生成素等[30]。骨髓腔和骨骺生長板的骨內膜區都是缺氧區，HIF-1α信號通路控制著這些區域的軟骨細胞和成骨細胞的功能[31]。研究結果表明，在發育中的成骨細胞中激活HIF-1α通路，增強了VEGF介導的骨血管形成，增加了骨的生成[32]。

4 結論

基于網絡藥理學的對臨床常用中藥復方二仙湯治療OP的分子機制進行了預測，揭示了二仙湯可能是通過TNF信號通路和HIF-1信號通路治療OP，為中藥復方的推廣應用以及中醫藥現代化研究提供了理論依據。