缺血性腦卒中動物模型研究進展

2020-06-03 07:02:24王晉晨熊曉星

醫學綜述 2020年10期

王晉晨，熊曉星

(武漢大學人民醫院神經外科，武漢 430060)

缺血性腦卒中是指腦部的供血動脈(頸動脈和椎動脈)狹窄或閉塞、腦供血不足，從而導致腦組織缺血壞死的一類疾病。我國的腦卒中發病率呈逐漸升高趨勢，缺血性腦卒中在臨床具有發生率高、死亡率高、致殘率高等特點，對人們的身體健康造成極大威脅[1]。神經細胞對于缺血缺氧損傷耐受性差，其在缺血性腦卒中發生后的數分鐘內可產生嚴重病變。同時腦卒中的情況又十分復雜，腦缺血時間及嚴重程度等對腦卒中的預后均會產生不同影響。因此，建立動物或細胞模型，進而為腦卒中的治療提供可能非常重要。一個好的腦卒中動物模型應當具備：①能夠控制缺血的時間、部位、程度；②與腦卒中相關的因素，如血壓、血氣、體溫、血糖等可以被控制；③避免其他疾病與腦血管解剖差異對實驗結果的影響。缺血性腦卒中模型經過多年的發展，已建立了多種成熟的模型，體內模型包括線栓模型、開顱電凝模型、光化學栓塞模型等，體外模型包括氧糖剝奪模型及器官型腦切片，這些模型為腦卒中的發病機制研究提供了基礎。每種動物模型均有其優缺點，現就缺血性腦卒中動物模型研究進展予以綜述。

1 缺血性腦卒中模型面臨的共同問題

1.1表觀遺傳差異有證據表明，將動物實驗的結果應用于人類時，不同物種之間的表觀遺傳差異有重要影響。通過對小鼠和人類包括大腦在內的15個組織進行RNA測序并比較其表達譜發現，同一物種不同組織中多組基因的表達存在顯著差異[2]。相關的表觀遺傳蛋白質組學研究進一步驗證了這些發現。在嚙齒類動物與人類之間，趨化因子的表達和進行氧糖剝奪后神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的反應均存在顯著差異[3]。另有研究表明，小鼠腦卒中后的趨化因子反應與缺血性腦卒中患者的尸檢結果比較存在顯著差異[4]。近年來，腸道菌群對身體的影響越來越受關注，考慮到不同飼養環境下小鼠的糞便微生物群已存在顯著差異，故其對包括腦卒中在內的各種疾病的研究可能產生巨大影響[5]。

1.2腦解剖和功能組織的差異人類與其他物種的大腦解剖結果存在明顯的宏觀差異。腦卒中動物模型多使用無腦回動物。不同部位的解剖及功能差異不同，梗死后表現也不盡相同。動物模型的梗死面積并不能充分反映人類的腦卒中情況。腦梗死發生的部位不同，所產生的臨床癥狀及其相應的預后也不同。同時，嚙齒類動物的腦白質比例遠低于人類，人類大腦中腦白質約占60%，犬約占35%，兔子約占20%，大鼠約占15%，小鼠僅占10%[6]。研究表明，遠端腦白質的完整性與大腦長期認知結果有顯著聯系[7]。在腔隙性腦梗死中，腦白質損傷起非常重要的作用。人類大腦的左右腦存在差異，左腦多負責計算及認知，而右腦負責情感及記憶。在嚙齒類動物中，雙側大腦中動脈閉塞所產生的癥狀不相同，右側大腦中動脈閉塞的大鼠可表現為短暫的亢進，而左側大腦中閉塞后未見這種表現[8]。

1.3血管解剖差異為了保護人類大腦免受血供變化的影響，在漫長的進化過程中人體產生了多種保護措施。首先是在入顱之前，頸總動脈可分為頸外動脈與頸內動脈。然后，位于大腦底部的Willis環連接前后循環及左右半球，當一側動脈閉塞時，Willis環可改變血流方向。最后復雜的側支循環系統會盡力保護腦皮質的供血[9]。在功能水平下，機體可通過血管收縮因子調節腦動脈的阻力，從而實現對腦灌注的調節。神經元的活動與腦灌注水平密切相關，這種現象被稱為神經血管耦合[10]。血管的結構及功能不同，腦卒中后腦組織的損傷也不同，且物種間的差異將導致缺血損傷結果不同。在C57BL/6J小鼠中，一個完整的Willis環出現的概率約為10%[11]。與Sprague-Dawley大鼠相比，Wistar大鼠的后交通動脈大鼠更細，且Sprague-Dawley大鼠存在約20%的血管變異[12]。這在一定程度上解釋了動脈栓塞后，即使在同一品系甚至同一批小鼠中，梗死面積也會存在高度差異的情況。

雖然動脈系統的解剖差異會導致腦損傷的變化，但功能上的差異對缺血產生的病理生理也存在較大影響。神經血管耦合與血腦屏障兩個在腦卒中病理生理中發揮關鍵作用的結構在人類與動物中明顯不同。人類血腦屏障的缺血性損傷可能主要與血管網的其他成分有關。而在小鼠和大鼠尸檢組織中均可在動脈、毛細血管和靜脈周圍發現白蛋白外滲[13]。

1.4免疫系統差異小鼠與大鼠的中性粒細胞比例為10%～20%，人類為50%～70%，而淋巴細胞比例相反，嚙齒類動物比例為50%～100%[14]。此外，在腦卒中發生后，嚙齒類動物中全基因組信使RNA與微RNA的表達變化與人類只有極小的交集[15]。腦卒中后，小鼠與大鼠的趨化因子網絡不同，同時嚙齒類動物與人類的小膠質細胞也存在很大差異[16]。由于缺血性腦卒中后炎癥被認為在缺血級聯的病理生理學和最終結果中起至關重要的作用，因此動物模型和人類腦卒中也會存在較大差異。

1.5實驗動物特異性在臨床實踐中，腦卒中最明顯的差異為人群所產生的差異。缺血性腦卒中在老年人群中多發，且患者多伴有糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖等基礎疾病，需多種藥物治療，多種因素對于腦卒中結果均有影響。而腦卒中實驗多是在沒有特定病原體的條件下，對健康雄性小鼠進行的研究。腦卒中實驗可以在標準化的條件下，將梗死面積變異性降到最低，這與現實情況存在很大區別。

1.6麻醉腦卒中模型與人類腦卒中的一項基本不同為動物模型均需要麻醉，麻醉藥物除了對血壓、腦血流及代謝的影響外，還可能具有神經保護作用，從而對腦卒中結果產生影響[17]。實驗中常用的麻醉藥物均為全身麻醉藥物，分吸入麻醉及注射麻醉兩種。常用吸入性麻醉藥物主要為異氟烷，注射用麻醉藥物主要為戊巴比妥鈉及水合氯醛。吸入性麻醉誘導平均、迅速，蘇醒也很快，較注射麻醉更加安全。

2 體外腦卒中模型

缺血性腦卒中的復雜情況導致無法在沒有完整的血管、血流以及白細胞浸潤的單細胞或腦組織中建模。而體外模型可以通過剝奪細胞的能量來源模擬腦缺血，進而研究特定的分子機制。誘導模擬腦缺血的方法主要有兩種：氧糖剝奪和阻斷細胞代謝的化合物或酶。在體外模型中，最常用的為氧糖聯合剝奪，在低氧環境中，正常的O2/CO2被N2/CO2所取代，而培養基中則省略了葡萄糖。通常，細胞培養物暴露于氧糖剝奪環境中1～24 h可引起廣泛的神經元死亡[18]。而模擬腦缺血再灌注損傷可通過回歸正常培養條件來實現。

體外模型中主要有兩種細胞模式：器官型腦切片與原代細胞培養。器官型腦切片具有結構方面的優勢，可保持神經元形態、膠質細胞及神經網絡連接。所有的體外模型主要模擬全腦缺血的情況，而腦切片更好地模擬局灶性腦缺血的情況。缺血半暗帶中可發現神經元逐漸去極化，體外模型中器官型腦切片可模擬這一情況。此外，大腦切片可從人類腦組織中制備出來，并進行氧糖剝奪試驗[19]。體外建立血腦屏障模型是了解腦卒中病理生理過程的一種重要方法，但血腦屏障只是由內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞和神經元所組成的神經血管單元的部分。

3 幾種常見動物模型及其優缺點

3.1線栓模型嚙齒類動物缺血性腦卒中最常用的實驗模型為大腦中動脈栓塞模型，該模型不需要開顱。其沿頸內動脈插入線栓并向前推進，直至大腦中動脈起始部被阻斷。線栓模型主要用于永久性缺血模型，也可以作為局灶性缺血模型，可通過拔除線栓的方式實現再灌注。通常情況下，大鼠再灌注時間為栓塞后60～120 min內，可導致同側半球大部分神經元延遲死亡或壞死。而線栓模型在梗死后120 min或更長時間可導致鼠類下丘腦閉塞，從而導致自發高熱，在人類中較為罕見[20]。Carmichael[21]指出，在嚙齒類動物中，線栓法所致腦梗死可能與頸內動脈閉塞所致大面積腦梗死較為相似，但與通常情況下小面積腦梗死不同。雖然線栓模型對腦缺血的病理生理學，特別是缺血半暗帶、血腦屏障損傷、炎癥過程、細胞死亡機制等研究提供了大量知識，但仍存在嚴重問題。在人類腦梗死中，血管閉塞往往不完全，大多數患者在腦卒中48 h內因血栓的溶解發生部分自發再灌注[22-23]。在線栓模型中，拔除線栓后可導致全部再灌注，與人類情況不完全相同，而與機械取栓情況較為相似。

3.2開顱電凝模型除了線栓模型，還可以通過直接閉塞腦表面血管引起局灶性缺血。通過外科手術方法灼燒或結扎腦部血管，可造成永久性腦梗死，不發生再灌注。但在制作模型過程中必須打開硬腦膜，故模型大腦可能直接受到鉆孔器損傷，或因電凝血管而受到腦部熱損傷[24]。同時打開硬腦膜之后，大腦暴露于空氣中，顱內壓受到影響，局部腦區溫度也會發生改變[25]。但與線栓模型相比，開顱電凝模型狀態穩定，成功率較高，且可以實現大型動物(如犬類)腦梗死。

3.3光化學栓塞模型在光化學栓塞模型中，靜脈注射孟加拉玫瑰紅光敏感性染料后再使用特定波長的光透過顱骨照射大腦，光照可激活染料，形成單線態氧和超氧化物，進而導致血管內皮損傷，血小板活化和聚集，最終使動脈末端缺血細胞迅速死亡，從而導致皮質缺血損傷。該模型的一個優點為利用立體定向儀激活特定的區域，從而研究特定皮質腦區梗死性病變。另一優點為高度重復性和較低的變異率與死亡率，這使其成為研究腦梗死后修復機制及長期功能結果的模型[26-27]。但這個模型與人類腦卒中情況仍存在差異，主要包括以下兩點：①腦卒中的主要特征為細胞毒性水腫，而光化學栓塞法中細胞毒性水腫與血管源性水腫幾乎同時發生，血腦屏障迅速破壞[28]。②腦卒中沒有缺血半暗帶及側支循環，而缺血半暗帶是神經保護治療的重點。利用環形濾波器(環形模型)來調整光照參數，可得到一個沒有血栓形成、被受損大腦包圍的中心區域[29]，但是這個模型能否充分代表人類腦卒中后的缺血半暗帶仍存在爭議[21]。一般情況下，構建光化學栓塞模型需要對動物進行麻醉，但有一種新方法允許大鼠、小鼠自由活動，同時進行光誘導，這種方法可以實時分析急性腦卒中多種參數，同時避免了麻醉的干擾[30-31]。

3.4內皮素-1模型內皮素-1是一種可持續收縮血管的肽，可應用于暴露的血管或直接在腦表面或注射到腦實質內導致血管收縮，從而引起遠端缺血[32]。通過調整內皮素-1水平可以改變腦缺血的嚴重程度、持續時間以及由此引起的梗死面積。當內皮素-1作用減弱時，血流量逐漸恢復，可模擬暫時性局灶性腦缺血情況。由于內皮素-1應用后缺血發展緩慢，且僅伴有輕微腦水腫，所以與人類缺血性腦卒中存在差異[33]。與光化學性栓塞模型相似，內皮素-1模型對腔隙性腦梗死的模擬與長期的恢復機制也有重要研究價值。然而，內皮素-1、內皮素-1轉化酶和內皮素-1受體不僅由內皮細胞表達，還存在于神經元和星形膠質細胞中[34-35]。此外，有研究表明內皮素-1可用于誘導星形膠質細胞增殖，這對于腦卒中后恢復機制的研究可能造成影響[21]。

3.5凝塊栓子栓塞模型凝塊栓子栓塞模型分為血栓栓塞性及非血栓栓塞性腦卒中模型兩類。在血栓栓塞性模型中，凝塊可從自發形成或血栓素誘導的血栓物質中獲得，主要來自自體血，也可來自異體血[36]。根據血栓的大小、數量及應用給藥途徑，可以導致一個或多個血管阻塞，隨后在相應供血區域發生梗死。也可將凝血酶直接注射到頸內動脈或大腦中動脈模擬血管閉塞，但血凝塊主要由纖維蛋白組成，與人類腦卒中仍存在差異。與人類情況相似，栓塞模型在梗死灶定位及梗死面積上存在很大差異，在栓塞材料部分或完全溶解后再灌注也不可預測，但相較于其他模型更加接近臨床情況。因此，血栓模型是用來研究重組組織型纖溶酶原激活劑治療的理想模型。凝塊栓子栓塞模型與人類缺血性腦卒中的病理生理學較為吻合，主要包括由血管源性水腫引起的細胞毒性水腫與血腦屏障破壞、缺血半暗帶及炎癥反應[37]，不僅可以分析急性期的變化，還可以分析慢性期的自我恢復機制。與人類腦卒中相似，凝塊栓子模型存在巨大的可變性，需要較多的動物模型才能獲得具有統計學意義的結果。

3.6微球/巨球栓塞模型目前，已有許多材料(硅酮、膠原蛋白或二氧化鈦)被應用于動物模型[36]。與血栓栓塞模型相比，人造微球無法溶解，可形成永久性缺血[38]。微球的直徑為20～50 μm，注射后24 h可導致多灶性及非均質性梗死[39]。此模型主要用于模擬短暫性腦缺血發作，可以根據微球的大小及數量誘導分級梗死[37]。在微球模型中，毛細血管及小動脈被阻塞，導致血流重新分布，血腦屏障破壞，發生血管源性水腫[40]。

巨球模型直徑為300～400 μm，可放置入頸內動脈導致大腦中動脈閉塞[38]。腦缺血與梗死的嚴重程度可由6個球體來決定。梗死后血流動力學、病變部位、梗死面積及結果與線栓模型相似。與線栓模型相比，巨球模型并未阻塞下丘腦動脈，因此不會出現體溫升高表現。對大鼠進行磁共振成像或正電子發射計算機斷層顯像時，可延遲閉塞以誘導缺血，實時觀察梗死后改變[41]。

上述腦卒中模型的優缺點總結見表1。

4 動物模型風險與并發癥

近年來，將嚙齒類動物及非人類靈長類動物的神經保護研究應用于缺血性腦卒中患者持續失敗。除實驗本身外，其主要原因為絕大多數實驗使用年輕、健康的雄性小鼠。故人們嘗試用糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、高脂血癥、肥胖或感染等較為常見的疾病動物模型來研究腦卒中，年齡與性別的影響也被進行研究。在年老動物的實驗中，相較于年輕動物，其神經損傷增加，再生能力降低[43]。有證據表明，年齡與上述各種危險因素會產生協同作用，導致炎癥程度升高，從而更易發生腦卒中[44-45]。此外，性別是影響腦卒中發生率和預后的另一個重要因素。

在腦卒中危險因素建模時，有兩種主要的實驗策略：①建立具有內在危險因素的動物模型，最終導致自發性腦卒中，這種方法被廣泛應用于高血壓動物模型。雖然這些模型與人類腦卒中情況更為相近，但成本高，且極其耗時。②在預先存在危險因素的動物中誘導腦卒中，但與人類的真實情況存在差異。設計實驗性缺血性腦卒中的主要困難為如何在人類各種因素相互作用的高度復雜性和特定科學問題研究之間找到平衡點。

5 小結

缺血性腦卒中發病原因較為簡單，即血供中斷，遠端組織損傷。但同時缺血性腦卒中又非常復雜，大量因素對腦卒中的結果均有影響，如局部缺血的持續時間及嚴重程度，血壓的高低，梗死的病因以及年齡、性別、基礎疾病和遺傳背景等。但腦卒中不是單一的神經系統疾病，而是一種系統性表現，如動脈粥樣硬化、炎癥或感染等，這些疾病可能導致大腦以外其他器官的梗死。缺血性腦卒中的實驗模型對

表1 不同缺血性腦卒中模型的優缺點