microRNA在白癜風發病機制中的研究進展

蘇夢云，雷鐵池

(武漢大學人民醫院皮膚科，武漢 430060)

白癜風是臨床常見的局限性或泛發性色素脫失性疾病，全球白癜風的發病率為0.5%～2%[1-2]。白癜風病變組織的病理學特征為白斑皮損區黑素細胞功能的破壞以及黑素細胞數目的減少，以肉眼可見的色素脫失斑為主要臨床表現，發生于顏面部、四肢等皮膚暴露部位的白斑，具有一定的損容性，對患者尤其對青少年的身心健康及社交產生消極影響[3-4]。目前白癜風的發病機制尚不完全清楚，所涉及的致病因素主要包括自身免疫因素、氧化應激因素、黑素細胞自毀因素、神經精神因素以及遺傳易感因素等[5-6]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，通過靶向特異性結合靶基因的3′非翻譯區啟動基因轉錄后水平調控，達到降解靶基因及抑制翻譯的目的。近年來，多項研究表明，miRNA在生物生長發育過程中起著重要的調控作用，分別參與了細胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤的轉移和侵襲等過程，部分miRNA已成為某些疾病診斷及預后判斷的生物學指標物[7-10]。白癜風患者相關miRNA的異常表達證實，miRNA在白癜風發病機制中具有重要作用[11]。目前，臨床缺乏有效的白癜風治療手段，迫切需要尋找監測有害免疫事件發生的有效生物學指標，以便于預測白癜風進展，評估治療效果及治療后復發情況。現就近年來miRNA在白癜風發病機制中的研究進展予以綜述。

1 miRNA的生物合成過程

miRNA存在于真核細胞生物中，由20～22個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小RNA，其作用機制是通過與靶基因的3′非翻譯區特異性結合，抑制翻譯及降解靶基因，啟動基因轉錄后水平調控，參與約30%的人類基因組調控[12-14]。在真核生物細胞核內，miRNA由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉錄而來，率先生成具有莖環結構的最初轉錄本初級miRNA(pri-miRNA)，其中包括聚合酶A尾和7′甲基化帽子結構，隨后在RNA酶Ⅲ Drosha、RNA結合蛋白以及迪喬治綜合征危象區基因8的作用下，形成約70個核苷酸大小的環狀前體miRNA(pre-miRNA)，繼而由核轉運子5(exportin 5)將其從細胞核轉移至細胞質內，在RNA內切酶Dicer酶的作用下生成雙鏈miRNA，經過RNA解旋酶解旋后，其中一條鏈被迅速降解，另一條鏈則發育為成熟miRNA，隨即與Argonaute(AGO)蛋白家族相結合，形成了RNA誘導的沉默復合體，該復合體通過與靶基因3′非翻譯區特異性結合，達到降解靶基因的目的[15-16]。

2 miRNA與白癜風的發病機制

2.1miRNA與氧化應激 內源性或外源性因素，如紫外線照射、創傷、應激、感染等均會導致體內活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的產生，而氧化應激是白癜風發生的始動因素[17]。研究表明，白癜風患者體內存在氧化及抗氧化系統的失衡，導致表皮黑素細胞損傷，且白癜風皮損邊緣處過氧化氫水平顯著升高，為正常生理水平的1 000～10 000倍，表明白癜風患者皮損處存在過氧化氫蓄積過度[18]。目前，關于miRNA在氧化應激條件下誘導黑素細胞變性死亡的分子機制尚不清楚。通過測序分析比較白癜風患者與正常健康人群血清miRNA的研究顯示，白癜風患者有48種miRNA的表達較正常人群高4倍以上，其中let-7b、miR-16、miR-451、miR-25、miR-15b的表達量最高[17]。分別將miR-25 mimic(模擬物)和miR-25 inhibitor(抑制劑)轉入黑素細胞，進而對過氧化氫環境下黑素細胞的研究發現，模擬物組黑素細胞凋亡率明顯增加，而抑制劑組則相反，證實miR-25過表達不僅降低了抗凋亡B淋巴細胞2的表達，同時也上調了促凋亡蛋白的表達，包括B淋巴細胞2相關X蛋白、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-9等的活性，并可促進氧化應激環境下黑素細胞的凋亡，證實了miR-25與白癜風病理發生的相關性[19]。此外，miR-25過表達還可抑制酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白1、酪氨酸酶相關蛋白2等黑素合成相關蛋白的表達，并可抑制酪氨酸酶的活性，從而減少黑色素的生成。除直接作用于黑素細胞外，氧化應激條件下miR-25 mimic還可抑制角質形成細胞生長因子(如干細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子)的產生及分泌，使用miR-25 mimic處理后的上清液再次處理黑素細胞發現，經過氧化氫氧化后，miR-25過表達的角質形成細胞喪失了對黑素細胞的保護能力，導致黑素細胞凋亡增加，可見氧化應激能夠促使miR-25啟動子區域脫甲基化，誘導黑素細胞及角質形成細胞中miR-25表達的增加，通過直接作用促進黑素細胞的變性凋亡，亦可在氧化應激下通過干預角質形成細胞旁分泌間接促進黑素細胞的凋亡[19]。

張瑩[20]對過氧化氫處理人永生化黑素細胞系PIG1及PIG3V進行miRNA芯片技術分析發現，miR-93、miR-320b、miR-423-5p在兩種黑素細胞系的表達存在差異性變化。聚合酶鏈反應檢測結果顯示，僅miR-423-5p的表達水平與miRNA芯片結果相一致；且生物學軟件分析顯示，谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GSTM1)可能作為miR-423-5p的靶基因[21]。將特異性miR-423-5p前體物及抑制物分別轉染至PIG1、PIG3V兩種黑素細胞中，借以調控miR-423-5p表達的研究顯示，在氧化應激(過氧化氫)環境下，經miR-423-5p前體物處理黑素細胞組miR-423-5p表達水平較未經miR-423-5p轉染組明顯上調，凋亡比例顯著增大，細胞活力降低，細胞內ROS及丙二醛水平異常升高，而經抑制物處理黑素細胞組miR-423-5p表達水平下降，細胞活力增加，凋亡細胞比例減少，細胞內ROS、丙二醛水平降低，證實miR-423-5p很可能通過特異性靶向結合GSTM1參與白癜風氧化應激過程，miR-423-5p表達水平的變化將直接影響GSTM1蛋白水平的表達[20]。綜上所述，miR-423-5p通過下調GSTM1表達參與白癜風的氧化應激損傷過程，是調控人黑素細胞氧化應激損傷的危險性因素。

白癜風皮損中受損黑素細胞的抗氧化能力及線粒體能量代謝均出現異常，使其對氧化應激的敏感性增強，易導致黑素細胞的退化變性[22]。機體內ROS的過度蓄積可以導致細胞膜過氧化，線粒體膜電位降低導致白癜風表皮中黑素細胞及角質形成細胞發生空泡化及凋亡。Sahoo等[23]發現，白癜風皮損中miR-211表達水平顯著下降，可通過靶向結合過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1及過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子1α基因(線粒體及糖原合成的關鍵調控子)的3′非翻譯區，使兩者表達水平上調，降低線粒體氧化磷酸化復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的水平，導致線粒體能量代謝異常及結構破壞，進而導致體內ROS水平的升高，大量ROS蓄積導致黑素細胞核DNA破壞，產生大量促炎因子及抗黑色素合成細胞因子，引起細胞毒性反應，通過刺激機體發生自身免疫反應參與白癜風的發生。

2.2miRNA與自身免疫因素 白癜風是由T細胞介導的自身免疫性疾病。目前，血清中已檢測出部分功能性miRNA，并已作為臨床多種疾病預測、診斷、預后判斷和治療的生物學指標。有學者發現，將Tyrp1B-WRag1-/-Tyrp1特異性轉基因鼠的CD4+T細胞轉入敲除Rag1小鼠5～6周后，宿主小鼠發生白癜風；8周后，色素脫失面積大于體表面積50%時，白癜風小鼠血清中的188種miRNA在兩組中均表達，20種miRNA存在明顯的差異性表達，其中 miR-146a、miR-191、miR-342-3p在白癜風小鼠中表達增加[24]。另有研究顯示，miR-146a不僅可調控CD4+T及自然殺傷細胞的功能，還可促進腫瘤壞死因子-α的產生，并可上調巨噬細胞活性，這一調控機制可能是miR-146a參與白癜風病理發生的重要基礎[25]。此外，類風濕關節炎患者外周血單核細胞中miR-146a的表達明顯亦增加，是正常人群的2.6倍，表明miR-146a也參與了其他自身免疫性疾病的發生[26]。對非節段型白癜風(non-segmental vitiligo，NSV)患者與健康人群血清miRNA的研究證實，miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92與機體免疫相關，miR-17-92簇在輔助性T細胞1的應答中具有重要作用，其中白癜風患者血清miR-19a和miR-19b呈高表達，通過干擾素抑制T細胞產生，通過調控輔助性T細胞1的應答參與白癜風的發生[27]。

miR-155是一種促炎miRNA，當病毒入侵機體或腫瘤形成時，miR-155及其靶基因細胞因子信號轉導抑制因子-1可調控CD8+效應T細胞。 miR-155缺失不僅可顯著下調CD8+效應T細胞的累積效應，導致腫瘤生長失控；還可通過細胞因子信號轉導抑制因子-1的蓄積調控信號轉導及轉錄激活因子5的表達，導致細胞因子缺乏[28]。研究表明，白癜風患者表皮中miR-155的表達增加，而腫瘤壞死因子-α、α干擾素、γ干擾素及白細胞介素-1β等炎癥因子可誘導黑素細胞及角質形成細胞中miR-155的表達，上述炎癥因子表達增加不僅可通過抑制黑素細胞分化及黑素合成相關基因的表達減少黑色素合成，還可通過與靶基因細胞因子信號轉導抑制因子-1的3′非翻譯區特異性的結合調控機體CD8+效應T細胞，導致白癜風病理發生[29]。

熱激蛋白(heat shock protein，HSP)60、HSP70和糖蛋白96是機體氧化應激及自身免疫反應的重要調控因子。HSP可激活樹突狀細胞，促進樹突狀細胞的吞噬作用，進而激活機體免疫反應。在氧化應激條件下，機體miR-1表達增加，通過靶向結合HSP60和HSP70的3′非翻譯區誘導細胞凋亡[30]。在白癜風皮損及非皮損組織中，HSP60和HSP70存在差異性表達，表明HSP70i參與了白癜風的脫色過程。將包含編碼Tyrp-1質粒(一種比酪氨酸相關蛋白-2更強的抗原，以檢測出最小的脫色反應)的疫苗接種于野生型C57小鼠及HSP70i敲除小鼠4周后發現，HSP70i敲除小鼠未出現色素脫失，而16.9%的野生型C57小鼠疫苗接種位置出現了色素脫失斑；與HSP70i敲除小鼠相比，野生型鼠浸潤T細胞數量明顯增加(>58%)，其中絕大多數T細胞僅表達CD3+CD8，少數位于真皮的T細胞可表達CD3+CD4+，推測miR-1通過靶向結合HSP70i影響T細胞表達，在白癜風色素脫失過程中起到一定的作用[31]。

2.3miRNA單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與白癜風易感性 除上述因素外，白癜風的發生與進展與遺傳因素相關，個體基因突變與白癜風易感性相關。SNP是最常見的人類基因突變形式，可影響基因的表達、轉錄、翻譯、修飾等，在疾病的發生發展中發揮重要作用[32-33]。目前，SNP可用于預測個體的藥物反應、對毒性環境因素的敏感性以及罹患某種疾病的風險。miRNA基因SNP的研究有助于進一步了解miRNA在疾病發生發展中的作用。因此，有研究首次通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術分析中國漢族人群miR-196a-2成熟區rs11614913的SNP與白癜風的關系，并對rs2910164、rs2292832、rs11614913、rs3746444四個SNP位點的基因型進行統計學分析證實，與TT和TC的聯合基因型相比，miR-196a-2 CC基因型個體白癜風的患病率降低；此外，通過生物信息學軟件預測發現，酪氨酸相關蛋白-1是miR-196a-2的靶基因，當miR-196a-2成熟區rs11614913基因位點為C時，能夠更有效地結合并調控靶基因酪氨酸相關蛋白-1，使其表達水平下降，進而使黑素細胞內ROS減少，降低早期應對過氧化氫誘導的黑素細胞凋亡的比例，提高黑素細胞抗氧化應激損傷能力，進而降低白癜風的患病風險[34]。

2.4miRNA與白癜風疾病活動度 全基因組關聯分析研究表明，白癜風的易感基因與免疫調控相關，NSV患者體內自然殺傷細胞以及由CD4+CD25+叉頭框蛋白p3+調控T細胞的數量和功能均存在缺陷[35]。對NSV患者及健康人群血清miRNA的檢測分析發現，有31種血清miRNA在NSV患者和健康人群呈2倍以上差異性表達，其中12種miRNA存在3倍以上差異性表達，且miR-16、miR-19b、miR-720可作為區別NSV的最佳血清生物學標志物。為進一步驗證血清miRNA改變與白癜風嚴重性的關系，分別對皮損面積<30%、<50%、>50%白癜風患者的基因分析發現，其中皮損面積>50%白癜風患者血清miR-574-3p顯著下調，提示miR-574-3p可能與白癜風的嚴重程度相關，但仍需進一步研究的證實[35]。此外，miR-16在類風濕關節炎、克羅恩疾病、潰瘍性結腸炎患者外周單核細胞的表達亦增加，且表達水平與疾病活動度相關，可見，miR-16在NSV及其他自身免疫性疾病中發揮重要作用。

3 小 結

隨著RNA干擾技術的發展，miRNA成為研究皮膚疾病臨床診斷及疾病病理發生機制的新途徑。miRNA在白癜風發病機制(氧化應激、自身免疫、遺傳易感性)中發揮了重要的調控作用，如miR-25、miR-423-5p、miR-211、miR-146a等均參與了白癜風的病理發生過程，但其確切機制尚需進一步研究的證實。積極探尋相關miRNA分子，將為白癜風發病機制的研究及臨床治療藥物的開發提供理論依據，隨著對miRNA的逐漸研究，其在皮膚病領域的應用將不斷深入，將為白癜風等皮膚疾病的安全有效治療提供幫助。