頭風顆粒對偏頭痛模型腦膜組織形態及中腦導水管周圍灰質c-fos、c-jun基因表達的影響

于明秀，呂文學，署文杰，孫西慶

(山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

偏頭痛是一種反復發作的神經功能障礙性疾病，主要表現為一側或雙側搏動性的劇烈頭痛，有發作性、搏動性的特點，發作時生活和工作能力下降，嚴重危害患者身心健康。中醫藥治療偏頭痛已有幾千年歷史，積累了豐富的臨床經驗。經多年的臨床實踐，孫西慶教授用頭風湯治療偏頭痛臨床療效顯著[1]，頭風湯由加味二陳湯加減創制而成，具有清熱燥濕之功效。本課題研究中，將頭風湯做顆粒制劑，復制了偏頭痛大鼠模型，研究頭風顆粒對偏頭痛大鼠腦膜組織及中腦導水管周圍灰質c-fos、c-jun mRNA表達的影響，探究偏頭痛發病機制，探討頭風顆粒預防和治療偏頭痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，體重200～250 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001，合格證號0055920。

1.1.2 主要藥劑與儀器 頭風顆粒(山東中醫藥大學附屬醫院藥學部提供中藥材，制劑室加工制為散劑)；硝酸甘油注射液(5 mg/mL，北京益民藥業有限公司，國藥準字 H11020289，產品批號20160906)；10%水合氯醛溶液(魯藥準字 H01080291，產品批號：20161201)；0.9%氯化鈉注射液(500 mL：4.5 g，華仁藥業有限公司，國藥準字 H37021260，產品批號160806H2)；PBS緩沖液(0.01 M，pH=7.2～7.4，山東省醫科院實驗中心配制)；RNA逆轉錄試劑盒和SyBRGreen qPCR Master Mix試劑盒(invitrogen生物技術公司)，引物為上海生工合成；兔抗大鼠c-fos、c-jun抗體購自abcom公司；DAB顯色試劑盒劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.1.3 主要實驗器材 腦立體定位儀(深圳瑞沃德(Reward)公司)；大鼠冠狀面腦模具(深圳瑞沃德(Reward)公司)；全自動組織脫水機(德國Lica公司，Asp300型)；石蠟組織包埋機，(德國Lica公司，EG1160型)；恒冷箱切片機(德國Lica公司，CM1850型)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；光學顯微鏡(德國Leica公司)；超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備公司)；微量加樣槍(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(德國Eppendorf公司)；Milipore超純水機(法國Milipore公司)；Roche LightCycler 480II PCR儀(德國羅氏公司)；Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo公司)；Leica DM480圖像分析系等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥 120只SD大鼠在相同條件下適應性喂養1周，隨機分為正常對照組、模型組、頭風顆粒治療組和頭風顆粒預防組，每組各30只。給予模型組、頭風顆粒治療組和頭風顆粒預防組大鼠造模，建立實驗性偏頭痛動物模型，方法為皮下注射硝酸甘油注射劑，劑量按體重10 mg/kg；正常對照組皮下注射等量的生理鹽水。造模30 min后，給予模型組大鼠灌胃蒸餾水，劑量按體重1.04 mL/kg；給予頭風顆粒治療組大鼠灌胃頭風顆粒，劑量按體重1.04 mg/kg；在建立模型前給予頭風顆粒預防組大鼠灌胃頭風顆粒1周，劑量按體重1.04 mg/kg。

1.2.2 模型制備 大鼠稱重，以10 mg/kg計算GTN用量，皮下注射GTN誘發偏頭痛模型，造模成功判定：造模后5～10 min，大鼠即出現雙耳發紅、爬籠次數增多、前肢頻繁撓頭、煩躁不安等現象，約30～60 min達高峰，持續約3 h后，大鼠呈現活動減少、蜷臥狀態。

數據分析采用GraphPad Prism5軟件統計分析并作圖，計量資料以均數±標準差(±s)表示，各組之間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

在構建學習共同體時，應該遵循“組內異質，組間同質”的原則，以學習者特征分析數據為依據，以促進溝通交流為目的，從而為課堂活動的順利展開打下基礎。

1.2.5 實時熒光定量PCR(Rt-PCR) ①解剖學定位取材：取材過程中為保證每只動物的取材位置在PAG的相同位置，應用了腦模具和前囟標記的方法，以此保證取材盡可能是在相同位點。快速取出大鼠中腦PAG。(備注：3只動物的PAG作為一個樣品)。②總RNA提?。翰捎肨RIzol法提取各組總RNA，抽取獲得的RNA經鑒定及定量分析后，進行反轉錄合成cDNA，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5min。取2ulcDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應，反應條件：變性 95 ℃ 10s、退火60 ℃ 30s、延伸72 ℃ 10s，共40個循環。實時熒光定量PCR法(Rt-PCR)檢測PAG中c-fos和c-jun mRNA的表達，以β-actin為內參。c-fos上游引物為5′-GAGGGAGCTGACAGATACGC-3′，下游引物為5′-CTCGGGGTAGGTGAAGACAAA-3′；c-jun的上游引物為5′-CGTTCCTCCAGTCCGAGA-3′，下游引物為5′-AAGTTGCTGAGGTTGGCG-3′；β-actin上游引物為5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3′，下游引物為5′-TACAGCCCGGGGAGCATCGT-3′。③實驗數據的標準化：在qRT-PCR反應結束之后，得到各個標本組織的表達Ct值，Ct值為反應實時熒光強度達到設定閾值所經過的擴增循環數，擴增呈現對數增長，與組織標本的起始拷貝數呈現反比。樣本△Ct=待測基因Ct的平均值-參照基因Ct的平均值。采用2(-△△Ct)法計算得出相對表達量。

1.2.4 腦膜組織形態觀察 將腦膜從顱骨上分離，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腦膜組織形態。

肉食要減少。我國近十年腸癌和乳腺癌發病率上升很快，這些癌癥都屬于“西方型腫瘤”，主要原因就在于肉食過多，身體中攝入過多脂肪和熱量，導致膽汁酸和牛黃膽酸等過多、內分泌失調而誘發腫瘤。另外，治未病很重要的是戒煙、限酒。

除正常對照組外，其余三組大鼠均造模后5～10 min開始出現雙耳發紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、煩躁不安的現象，均在31～60 min達到高峰。大約60 min后頭風顆粒治療組和預防組的動物活動逐漸減少，90 min后模型組動物活動開始減少，90～120 min及120～150 min時間段治療組、預防組撓頭次數與模型組比較，減少明顯。150 min后頭風顆粒治療組和預防組大鼠逐漸趨于正常。模型組大鼠上述現象持續時間較長，持續約3 h，大鼠活動逐漸減少。

1.2.3 標本制備 常溫下，用10%水合氯醛3.5 mL/kg對大鼠進行腹腔麻醉，充分放血后，超凈工作臺冰上迅速斷頭，取部分系著腦膜的顱骨放入4%多聚甲醛(4 ℃)中備用。然后完整取出鼠腦，迅速剝離出中腦導水管周圍灰質，放入1.5 mL滅菌的離心管，標記后置于液氮內冷凍保存。

偏頭痛的發作與多種因素有關，包括遺傳、飲食、內分泌以及精神因素等，其發病機制至今尚未明了，較為公認的有三叉神經血管學說、皮層擴散性抑制學說。近年來研究較多的是三叉神經血管學說[2]，該學說概括偏頭痛的發病機制為以下三個方面：腦膜血管擴張、神經源性炎癥形成、中樞神經元功能異常[3-4]。偏頭痛動物模型種類較多，其設計原理均是根據偏頭痛發病機制而來，應用較廣泛的為硝酸甘油型偏頭痛動物模型。硝酸甘油型偏頭痛模型屬于神經血管反射機制模型，此模型操作技術簡單，實驗動物經濟、易于獲得，模型癥狀與偏頭痛臨床癥狀相似性好，造模因素單一穩定，可在短期內大量復制[5]。本項目中，采集硝酸甘油型偏頭痛模型中腦導水管周圍灰質(PAG)標本，通過蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組大鼠腦膜組織形態。結果發現，與正常組比較，模型組大鼠腦膜毛細血管擴張明顯，血漿蛋白外滲，血管周圍肥大細胞脫顆粒，大量炎性細胞滲出，這些現象也證實了皮下注射硝酸甘油可引起腦膜毛細血管擴張、神經源性炎癥形成，給藥干預組較模型組上述現象明顯減輕，可見頭風顆粒能顯著減輕硝酸甘油引起的神經性炎癥。

1.3 統計學處理

作為與醫學相關聯的學科，藥學教育的目標是培養從事藥物研發和藥學服務的專業人才。目前世界多國為加強藥學生的職業責任感，均采用了宣誓儀式。

2 結果

2.1 大鼠癥狀行為學變化

中國在維和行動中的領導決策能力尚未得到有效體現。在當今世界，國際規則往往由一些發達國家制定，在國際安全領域的聯合國維和行動也不例外，很多情況下，維和人員派遣國無法充分參與維和行動各階段的所有工作。一些國家（其中大部分為發展中國家）提供了大部分維和人員，卻很少有機會參與維和決策，他們提供的一些有價值的意見也很少被采納。中國作為參與國，因受種種因素的限制，在維和行動中很難起到主導作用。

2.2 大鼠腦膜組織形態學觀察

顯微鏡下可見c-fos、c-jun免疫反應陽性的神經元細胞呈棕黃色，主要分布在PAG區，尤其在PAG的腹外側區，且呈雙側對稱分布(鏡檢圖片見圖5-12，200X)。正常對照組大鼠PAG區可見一定陽性細胞，偏頭痛模型組大鼠PAG區c-fos和 c-jun陽性細胞數明顯增多，與正常對照組比較有顯著統計學差異(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較，頭風顆粒治療組和預防組c-fos和c-jun陽性細胞數明顯減少，有顯著統計學差異(P<0.01)。見表1。

圖1 正常組

圖2 模型組

圖3 預防組

圖4 治療組

2.3 頭風顆粒對偏頭痛模型大鼠PAG區c-fos、c-jun mRNA表達的影響

應用 real-time PCR方法檢測各組大鼠中腦導水管周圍灰質的c-fos、c-jun mRNA的表達。c-fos、c-jun mRNA相對表達量，以正常對照組為1，各組大鼠PAG區c-fos mRNA相對表達量見圖5，各組大鼠PAG區c-jun mRNA相對表達量見圖6。與正常對照組相比，偏頭痛模型組大鼠PAG區c-fos、c-jun mRNA表達明顯增強；與偏頭痛模型組比較，頭風顆粒預防組和頭風顆粒治療組大鼠PAG區c-fos和c-jun mRNA表達明顯減弱。

注：正常對照組1，模型組5.310652，治療組1.439488，預防組1.174643

注：正常組1，模型組5.798001，治療組1.665038，預防組1.262835

2.4 各組大鼠PAG區c-fos和 c-jun陽性細胞數比較

鏡下觀察腦膜毛細血管、炎性細胞滲出現象及組織細胞形態(圖1、圖2、圖3、圖4)。正常對照組：毛細血管正常，腦膜組織結構緊密。模型組：毛細血管擴張，組織水腫，細胞間結構疏松，大量炎性細胞滲出。頭風顆粒治療組：腦膜血管擴張不明顯，細胞間結構較疏松，有少量炎性細胞滲出。頭風顆粒預防組：毛細血管擴張不明顯，部分血管周圍有少量炎性細胞滲出。

組別動物(只)c-fos(個)c-jun(個)正常對照組 1211.96±0.9213.32±0.61偏頭痛模型組 1282.96±2.08?88.53±1.25?頭風顆粒預防組1223.44±1.59△27.81±1.46△頭風顆粒治療組1222.90±1.15△24.58±0.74△

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與偏頭痛模型組比較，△P<0.01。

2.5 各組大鼠PAG區 c-fos和c-jun陽性細胞灰度比較

與正常對照組比較，偏頭痛模型組c-fos和c-jun陽性細胞灰度減弱，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；與偏頭痛模型組比較，頭風顆粒治療組和預防組c-fos和 c-jun陽性細胞灰度明顯增強，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表2。

組別動物(只)c-fosc-jun正常對照組 12241.06±1.91237.79±2.91偏頭痛模型組 12193.26±1.48?181.61±1.64?頭風顆粒預防組12222.63±2.71△216.68±2.27△頭風顆粒治療組12227.79±2.17△219.89±1.86△

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與偏頭痛模型組比較，△P<0.01。

3 討論

1.2.6 鏡檢和圖像分析 光鏡下，陽性細胞細胞核染色體呈現棕黃色，多為圓形或者卵圓形。在200倍光鏡下全面觀察切片，隨機選取各組大鼠腦部切片上端和下端不重復的6個視野，對陽性細胞進行計數，利用Leica DM480圖像分析軟件分析每張切片上每個視野的平均灰度。

中腦導水管周圍灰質(PAG)是位于中腦頂蓋與被蓋之間，環繞中腦導水管周圍的一片區域，其頭側起自后聯合水平，尾側達藍斑核首側水平[6]。PAG具有極其復雜功能，是中樞神經系統中較重要結構，它參與痛覺調控，還與恐懼、焦慮、自主神經功能、睡眠等的調控活動密切相關[7]。作為重要的痛覺調整中樞[8]，中腦導水管周圍灰質既可接收來自脊髓和延髓的傷害性刺激，將疼痛信息向上傳遞至更高級中樞，又可抑制過度疼痛信息的下行傳遞[9]。

一般將PAG分為四個區：內側區、腹外側區、背外側區和背側區。PAG腹外側區在深部結構的傷害性疼痛信息處理中起重要作用，Tassorelli等[10]發現刺激中腦導水管腹外側區可出現情緒低落、心動過緩、低血壓等自主神經功能紊亂癥狀，而以上這些自主神經紊亂癥狀在偏頭痛發作時也伴隨出現；Raskin[11]研究中發現，在一組非偏頭痛患者PAG區植入刺激電極后出現偏頭痛樣頭痛發作，最早提出PAG為人類偏頭痛疼痛的中樞來源。另外，組織形態學[12]、影像學研究[13-14]等也有相關PAG與疼痛關系研究，均提示PAG在偏頭痛發病中具有重要作用。

即早基因c-fos、c-jun與痛覺調控關系密切，諸多研究表明，疼痛、創傷等傷害性刺激可誘發中樞神經系統(CNS)內即早基因家族c-fos、c-jun的表達，實驗研究中，偏頭痛模型中樞神經系統c-fos常被作為神經元激活的標記物。在即早基因與偏頭痛的關系研究中，Moskowitz[15]研究發現，偏頭痛發作可刺激三叉神經核尾核細胞內即早基因c-fos、c-jun大量表達，當服用治療藥物舒馬曲坦后，其表達受到了抑制；Cristina等[16]研究發現，偏頭痛發作時，下丘腦、腦干等處c-fos基因表達明顯增強，劉斌等[17]研究發現，偏頭痛模型大鼠中腦導水管周圍灰質、下丘腦 c-fos、c-jun基因表達增強。任永新等[18]研究證實偏頭痛大鼠模型腦干、下丘腦c-fos、c-jun基因表達增強，中藥頭風飲能顯著抑制基因高表達。

本項目實驗研究結果顯示：硝酸甘油型偏頭痛動物模型造模成功，造模后大鼠出現雙耳發紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多等癥狀行為學變化；鏡下觀察大鼠腦膜血管擴張，神經性炎癥形成；RT-PCR方法檢測發現，中腦導水管周圍灰質c-fos和 c-jun mRNA表達增強，中藥頭風顆粒預防給藥和治療給藥均能抑制其基因表達。與正常對照組相比，偏頭痛模型組c-fos和c-jun mRNA表達明顯增強、c-fos和c-jun陽性細胞數明顯增多；與偏頭痛模型組比較，頭風顆粒治療組和頭風顆粒預防組c-fos和c-jun mRNA表達明顯減弱，c-fos和c-jun陽性細胞數減少，有顯著統計學差異，P<0.01，說明頭風顆?？梢韵抡{PAG區c-fos和 c-jun基因表達，從而抑制痛覺信息的傳遞，從而發揮治療和預防偏頭痛的作用。

3.1 通過綜合實踐對單項課程的知識與技能進行融合 通過綜合實踐課程建設將原本被課程割裂的知識與技能進行深度融合，幫助學生整合現有的知識結構，以解決實際問題，讓學生能夠與具體工作領域的任務相對接。

綜上所述，頭風顆?？梢悦黠@減輕硝酸甘油引起的神經性炎癥，顯著抑制偏頭痛大鼠中腦導水管周圍灰質c-fos、c-jun基因表達，改善偏頭痛模型大鼠癥狀行為學變化，從分子機制上闡明了頭風顆粒預防和治療偏頭痛的作用機理。