HPLC法測定鼻炎康膠囊中歐前胡素的含量

馬海平，王 曼，許 尚，朱 軍

(1.長江大學附屬仙桃市第一人民醫院 藥學部，湖北 仙桃 433000；2.湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北 十堰 442008)

鼻炎康膠囊是湖北省仙桃市第一人民醫院的制劑產品，收載于《湖北省醫療機構制劑規范(2011年版)》，是由蒼耳子、白芷、薄荷、辛荑、桑白皮、黃芩、金銀花共7味藥材經煎煮、濃縮、干燥而成的硬膠囊劑中成藥，內容物為土黃色粉末，味微苦。具有消風散炎、宜通鼻竅的功效，可用于鼻塞流涕、鼻炎、鼻竇炎及過敏性鼻炎的治療。鼻炎康膠囊隸屬本院自制制劑，目前其質量控制標準只有相應藥材的薄層色譜鑒定和浸出物含量。質量標準相對寬松，缺少有效的含量測定方法來評估藥品藥效和安全性。白芷作為本處方中的主藥之一，是鼻炎康膠囊發揮療效的重要成分和保證。

白芷為傘形科當歸屬植物，始載于東漢《神農本草經》，名白，芳香，列為中品，性溫，味辛。具有解表散寒、祛風止痛、通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效[1]。白芷中含有豐富的異歐前胡素、歐前胡素、佛手柑內酯、珊瑚菜素、氧化前胡素等多種有機酸類成分[2]。

歐前胡素又名白芷乙素，屬于6，7-呋喃香豆素類化合物，廣泛存在于白芷、歐前胡、當歸、蛇床等藥用植物中，分子式C16H14O4，分子量270.209 96。性狀為白色粉末，不溶于水，易溶于弱極性有機溶劑，為重要的天然活性物質，具有鎮痛、消炎、抗腫瘤和抑制心肌肥大等藥理作用[3]。臨床上廣泛應用于藿香正氣水、龍葵銀消片和元胡止痛片等多種中藥復方制劑，是大鼠經胃白芷提取液后血漿中的主要成分[4]。《中華人民共和國藥典(一部)》已建立了中藥材白芷的相應質量標準，即利用高效液相色譜法測定白芷中歐前胡素的含量。本實驗參考該法，擬通過建立鼻炎康膠囊中歐前胡素含量測定的高效液相色譜法，建立全面可靠的鼻炎康膠囊制劑產品的質量控制標準，為患者提供安全有效的醫院制劑產品。

1 儀器與耗材

1.1 儀器

P1201型高效液相色譜儀(大連依利特)，UV230Ⅱ紫外-可見檢測器，AL204電子分析天平(梅特勒/精確度1×10-4g)，超聲波清洗器(KQ-50B)，移液槍(100-1 000 μL，賽默飛)。

1.2 耗材

歐前胡素對照品(上海源葉，99.8%，供含量測定用)；甲醇(色譜純，SIMARK)、水(純化水自制)、定量濾紙(雙圈11 cm)、微孔濾膜(Merck有機系0.45 μm)、一次性無菌注射器(5 mL)。

樣品：鼻炎康膠囊1批次若干瓶(仙桃市第一人民醫院制劑室制劑產品，0.4 g×20粒/瓶，批號20190203。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱，規格：250 mm×4.6 mm/5 μm；流動相為甲醇：水(55∶45)；檢測波長300 nm；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL，理論塔板數按歐前胡素計算不得低于3 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品0.020 8 g于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(2.080 mg/mL)。分別精密量取上述對照品儲備液0.8、2 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品中間液(33.28、83.2 g/mL)，分別精密量取上述83.20 μg/mL對照品中間液1.25、2.50、5.00 mL于50 mL的容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，制成2.080、4.160、8.320 g/mL系列濃度梯度工作液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5粒，精密稱定內容物重量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇45 mL，超聲處理60 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，定量濾紙過濾，取續濾液適量，用0.45 μm有機相濾膜過濾，濾液用進樣瓶收集，上機備用。

3 方法的驗證與確認

3.1 系統適應性分析

分別精密吸取上述“2.2.1”項對照品溶液及“2.2.2”項供試品溶液各10 μL，按“2.1”項色譜條件分析，歐前胡素對照品及鼻炎康膠囊供試品歐前胡素色譜見圖1(1號圖譜為供試品圖譜，2號圖譜為對照品圖譜)。結果顯示，在保留時間32.8 min處，對照品與供試品均出現一色譜峰，出峰時間高度重疊，峰形無明顯拖尾或前沿(拖尾因子1.01)，且供試品歐前胡素峰周圍基線平整，無明顯噪音或雜峰干擾，分離度5.29，理論塔板數85 496。結果表明，采用上述“2.1”項HPLC分離方法能夠有效分離鼻炎康膠囊中的歐前胡素成分。

圖1 歐前胡素對照品與鼻炎康膠囊供試品圖譜

3.2 空白分析

3.2.1 標樣空白 按以上“2.2.1”項所述，以超純水替代歐前胡素對照品配制標準樣品空白，按以上“2.1”項所述色譜條件進樣，得到標準樣品空白圖譜。如圖2所示(1號圖譜為對照品圖譜，2號圖譜為標樣空白圖譜)，標準樣品空白基線平整，噪音0.02 mV，漂移0.11 mV/30 min，圖譜無雜質峰出現。結果表明，對照品配制所用試劑對目標峰無干擾。

圖2 標樣空白/對照品圖譜

3.2.2 試劑空白 按以上“2.2.2”項所述，以純水替代鼻炎康膠囊供試品配制試劑空白，按以上“2.1”項所述色譜條件進樣，得到試劑空白圖譜。如圖3所示(1號圖譜為對照品圖譜，2號圖譜為試劑空白圖譜)，試劑空白在出峰時間32.8 min附近無干擾峰出現。結果表明，供試品前處理所用器皿和試劑未對目標峰產生干擾。

圖3 試劑空白/對照品圖譜

3.2.3 樣品空白 按以上“2.2.2”項所述，以在制劑工藝中不添加白芷原藥材(其余制劑工藝不變)所生產的膠囊替代正常制劑工藝生產的該批次鼻炎康膠囊作為供試品制備樣品空白，按以上“2.1”項所述色譜條件進樣，得到樣品空白圖譜。如圖4所示(1號圖譜為對照品圖譜，2號圖譜為樣品空白圖譜)，樣品空白在出峰時間32.8 min附近基線平整，無干擾峰出現。

圖4 樣品空白/對照品圖譜

3.2.4 結論 本次實驗所用試劑、器皿以及鼻炎康膠囊內除白芷外的基質未在歐前胡素目標峰附近產生干擾，結合峰形判斷，在32.8 min出現的峰為單一組分峰，組分物質為歐前胡素。

3.3 線性關系

按以上“2.2.1”項所述，分別配置濃度為2.080、4.160、8.320、33.28、83.20 μg/mL系列梯度工作液，并按以上“2.1”項所述色譜條件依次進樣。在保留時間32.8 min處，出現峰面積與進樣濃度呈線性相關的色譜峰組，該峰即為歐前胡素目標峰。以峰面積A為縱坐標(Y)，以對照品濃度C為橫坐標(X)，繪制標準曲線，進行線性回歸分析，得回歸方程為A=20.308C+8.818 3(R2=0.999 8)，如圖5所示。結果表明，歐前胡素在該分析條件下，在2.080～83.20 μg/mL濃度范圍內，其峰面積與其濃度線性相關性良好，滿足定量要求，如表1所示。

圖5 歐前胡素濃度-峰面積曲線

表1 歐前胡素濃度-峰面積曲線

3.4 精密度實驗

精密度的評價標準參考Horwitz方程[5]：CV=2(1-0.5lgw)，其中CV為變異系數，w為質量分數，用10的冪次指數表示，例如含量為1 mg/kg時，w=10-6。本次供試品鼻炎康膠囊中歐前胡素含量約為0.1%，相對標準偏差應小于3.7%。重復性標準暫定為該標準的1/3，即重復性相對標準偏差應小于1.2%，期間再現性相對標準偏差應小于3.7%。

3.4.1 重復性 按以上“2.2.2”項所述操作，制得一個供試品溶液重復進樣6次，數據如表2所示。結果表明，在重復性條件下，樣品、方法、儀器重復性良好，峰面積RSD=0.05%<1.2%目標值。保留時間無漂移現象，證明甲醇-水(55∶45)的流動相在分離體系中容易達到平衡且系統穩定性良好。

3.4.2 期間再現性 取同批次鼻炎康膠囊若干粒，取出內容物混勻，每次精密稱定2.000 g，共6次，置于50 mL容量瓶中，其后按以上“2.2.2”項所述操作，共制得6個供試品，每個樣品進樣兩次，峰面積取平均值。以上6次實驗由6名不同質檢員分別在6周內每周重復一次完成，實驗設計見表3。結果如表4所示，期間再現性RSD=0.78%<3.7%，符合要求。即該方法在本實驗室環境下，具有一定的人員和時間再現性。

表3 期間再現性實驗設計

表4 重復性數據

3.5 檢出限和定量限

本法未做檢出限和定量限相關系統性分析。供試品鼻炎康膠囊中歐前胡素含量約為0.1%(以內容物計)，按照稱樣量2 g，定容體積50 mL，稀釋倍數為1條件處理，上機濃度約為30 mg/kg，在線性范圍內。本法按標準曲線最低點暫定為定量下限，即LOQ=50 mg/kg，LOD=15 mg/kg(按定量限1/3計算)。該數據僅供參考，在沒有明顯基質噪音干擾的情況下，實際檢出限和定量限應顯著低于該擬定值，不同的供試品基質具有不同的噪音水平，所得結果不同，不具有普適性。

3.6 穩定性實驗

3.6.1 樣品穩定性 鼻炎康膠囊作為仙桃市第一人民醫院制劑產品，保質期為6個月，儲存條件為陰涼避光。按照該條件對同一批次的鼻炎康膠囊留樣，由同一名實驗員每月定期進行歐前胡素含量穩定性測試跟蹤，每次實驗進行3平行操作，含量取平均值。如表5所示，結果表明，在保質期內，鼻炎康膠囊中歐前胡素含量未隨時間推移出現顯著的趨勢性變化。即鼻炎康膠囊樣品在有效期內具有穩定性。

表5 鼻炎康樣品穩定性跟蹤

3.6.2 樣品處理液穩定性 取同一批次鼻炎康膠囊，按以上“2.2.2”項操作，得上機液，分別封裝于若干樣品瓶中，常溫避光保存。按以上“2.1”項所述間隔一定時間重復進樣，每次進樣2次，取峰面積平均值，進行穩定性跟蹤分析，結果如表6 所示。供試品處理液以甲醇為溶劑，在密封條件下，48 h內穩定性良好。穩定性試驗第3天，處理液出現渾濁，未進行上機測試。因此，建議同一批次檢驗工作在2天內完成。

表6 處理液穩定性跟蹤

3.6.3 標準溶液穩定性 按以上“2.2.1”項所述，制備濃度為8.320 μg/mL對照品溶液，分裝于若干樣品瓶中，分別冷凍、冷藏和常溫保存，定期上機檢測(上機前恢復至室溫)，每個樣品進樣3次，記錄峰面積取平均值，實驗設計及結果見表7。

表7 標準溶液穩定性跟蹤

結果表明，三種儲存條件下的歐前胡素對照品峰面積均未隨時間出現趨勢性變化。在密封條件下，歐前胡素標準品以甲醇為溶劑，在常溫、冷藏和冷凍溫度下均具有較好的穩定性，經實驗證明的有效期可達3個月。

3.7 準確性

由于沒有相應的市售鼻炎康基質質控樣品，本次準確性評價采用回收率測試。

取同批次鼻炎康膠囊若干粒，取出內容物混勻，每次精密稱定2.000 g，從置于50 mL容量瓶中起，按以上“2.2.2”項所述操作，測定內容物歐前胡素本底含量，重復6次取平均值，結果以mg/g計。

另精密稱定內容物2.000 g，置于50 mL容量瓶中，加入一定量歐前胡素對照品，按以上“2.2.2”項所述操作，測定加標樣品歐前胡素含量，計算加標回收率。加標濃度為本底含量的1/3(因本法中歐前胡素有檢出，且含量較高，因此未進行檢出限加標回收測試)，加標方式為歐前胡素儲備液2.080 mg/mL×0.25 mL。每個加標濃度重復6次，實驗結果見表8。

在本底含量1/3處進行加標回收測試，回收率均值為99.1%，標準偏差1.09%，本次回收率的測量不確定度按3倍標準偏差計算可得U=3.27%，即回收率范圍為95.83%～102.37%，與100%沒有顯著性差異。該結果表明，本法不存在系統性偏差，準確性符合要求。

表8 加標回收率

4 討論與分析

4.1 檢測波長的選擇

采用紫外全波長掃描，歐前胡素供試品溶液在300 nm處有最大吸收，靈敏度達到定量要求，因此將檢測器波長定為300 nm。

4.2 溶劑的選擇

歐前胡素不溶于水，易溶于弱極性有機溶劑，在甲醇中溶解性良好，以甲醇為提取溶劑的提取效果優于乙醇[6]。本法樣品前處理和對照品均以甲醇為溶媒，甲醇不僅可以充分有效萃取鼻炎康膠囊內容物中的歐前胡素(超聲萃取1 h后萃取液中歐前胡素含量不再增加，表明內容物中歐前胡素已萃取完全[7])，還能起到沉淀劑作用，沉淀難溶性雜質。經甲醇萃取后的續濾液為黃色澄明液體。對于部分基質顆粒較大供試品，建議先研磨過20目篩后再處理[8]，以增加萃取效率，也可采取冷凝回流法[9]或適當延長超聲萃取時間。本法萃取液的體積使用量為50 mL，一般使用6倍量體積的甲醇萃取效果較好[10]，需綜合考慮上機濃度等因素。

4.3 流動相的選擇

本法采用甲醇∶水=55∶45作為流動相，出峰時間32.8 min，理論塔板數符合要求，與相鄰色譜峰有效分離，無雜質峰干擾，如圖6所示。

圖6 鼻炎康膠囊歐前胡素色譜

鼻炎康為復方制劑，七味藥材經甲醇萃取后處理液組分復雜，雜質峰較多，從圖譜可以看出，在26 min前雜質峰出現頻繁。歐前胡素為弱極性物質，提高甲醇比例后在流動相中的分配系數增加，保留時間縮短，對pH不敏感。甲醇比例每提高1%，保留時間隨之減少5%。本法甲醇比例可以適當提高，以縮短出峰時間，減小峰展寬，但比例不宜超過60∶40，過高甲醇比例可能導致分離度降低，甚至雜質峰干擾。相反的，降低甲醇比例可以有效避免極性相對較高的雜質組分干擾，然而保留時間延長將導致峰展寬，基線噪音干擾，以及分析時間增加等問題。

4.4 鼻炎康膠囊的質量評價標準

鼻炎康膠囊是臨床常用的用于治療慢性鼻炎和鼻竇炎的藥物，在《湖北省醫療機構制劑規范(2011年版)》中，其質量標準尚只有白芷的薄層鑒別[11]，然而白芷藥材的TLC鑒別易受復方制劑中其他藥材的干擾，檢測結果不明顯。且單純的鑒別檢測并不能保證藥品的有效性和安全性。有文獻表明，歐前胡素攝入過量將導致神經系統、心血管系統和呼吸系統毒性，并具有給藥部位的局部刺激性[12]。建立可行有效的含量測定方法是當前鼻炎康制劑質量控制的當務之急。

本文探索的鼻炎康膠囊中歐前胡素含量測定高效液相色譜法，經過系統的方法學研究，具有良好的精密度、準確性和穩定性，且簡單易行，是對鼻炎康膠囊質量標準的有效補充，為鼻炎康膠囊的質量評價奠定基礎。