四種醫院制劑微生物限度檢查方法的適用性研究

余靜，劉亮鏡，徐斌

(蕪湖市中醫醫院，安徽 蕪湖 241000)

微生物限度檢查是藥品安全中的一項重要內容，也是藥品質量控制中的必檢項目之一。院內制劑多為中藥復方制劑，成分復雜，且部分中藥已被明確證實具有抑菌作用[1-2]，因此建立合適的檢驗方法以消除制劑本身對微生物生長的影響非常必要，可確保檢驗結果的科學性和合理性，為藥品安全提供保障。本次實驗中所研究的四個制劑為參術健胃膠囊、十七味大活血膠囊、玉夏膠囊及腰痹康顆粒，均是本院的明星制劑，是由我院制劑室和臨床專科共同研制而成的中藥復方制劑，臨床療效獨特，毒副作用少。其中腰痹康顆粒來源于我院名老中醫戴勤瑤三十多年的經方，由丹參、當歸、川斷、枸杞、杜仲、木瓜等多味名貴中藥組成，具有舒筋活血、補益肝腎、軟堅散寒等功效，可用于治療腰椎退行性病變。因臨床療效確切且不良反應少，可以長期服用而備受患者的青睞。玉夏膠囊是我院國家級重點?？聘哐獕褐行脑谥嗅t藥理論指導下，優選出的針對痰濕壅盛型的高血壓制劑，主要由玉米須、夏枯草、防己等組成。因其降壓平穩、療效確切而深受廣大高血壓患者的歡迎，使用患者已遍及全國各地。參術健胃膠囊是我院脾胃科的重要用藥，方由黨參、炒白術、茯苓、黃連等組成，具有健脾和胃、化濕消導的作用，常用于急慢性胃炎、食道炎及功能性消化不良等引起的上腹飽脹、隱痛、噯氣、嘈雜等癥狀。十七味大活血膠囊為我院省級重點專科骨科的重要用藥，方中主要含有延胡索、牡丹皮、當歸、丹參、桃仁、三七等17味中藥，具有活血化瘀、消腫止痛之功效，主要用于骨傷初期及手術后、肢體腫脹、疼痛等。本研究旨在建立四種醫院制劑的微生物限度檢查方法。報告如下。

1 試驗材料

1.1 樣品

玉夏膠囊三批(批號170321，170707，171108)，參術健胃膠囊三批(批號170202，170603，171017)，十七味大活血膠囊三批(批號170507，170823，171008)，腰痹康顆粒三批(170801，171103，171203)，以上樣品均由蕪湖市中醫醫院制劑室生產。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]由中國醫學菌種保藏中心提供。黑曲霉[CMCC(B)98003]由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基

胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、麥康凱液體培養基等脫水培養基均購自北京三科科技開發公司，并嚴格按照說明書要求配制滅菌后使用。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

取按規定培養的各菌株培養物1 mL，用稀釋液倍比稀釋至適宜的濃度，菌數均不大于10 000 cfu/mL，備用。

2.2 供試液的制備

取樣品各10 g，加至胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，混勻，作為1∶10的供試液。取1∶10的供試液加胰酪大豆胨液體培養基稀釋制成1∶20的供試液。

2.3 需氧菌和真菌及酵母菌總數計數方法的驗證

按照《中國藥典》2015版四部非無菌產品微生物限度檢查法(通則1105)[3]，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2.0之內。本次試驗中，需氧菌、真菌及酵母菌總數計數方法的驗證采用平皿法(各濃度的供試液均取1 mL)，檢驗結果見表1。試驗組：取制備好的菌液0.1 mL，分別加至各供試液中，混勻，使每1 mL供試液中含菌量均不大于100 cfu/mL。分別取1 mL加入無菌平皿后，傾注不超過45 ℃的相應培養基，按規定培養。菌液對照組：取2.1項下制備好的各菌懸液0.1 mL，加至10 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻。分別取1 mL加至無菌平皿，其中白色念珠菌和黑曲霉用沙氏葡萄糖瓊脂注皿，35 ℃培養3～5 d；其他各試驗菌株用胰酪大豆胨瓊脂培養基注皿，25 ℃培養5 d。以上各菌株均平行測定2皿，菌數均不大于100 cfu/mL。供試品對照組：除不加菌外，其余操作同試驗組。

表1 需氧菌和真菌及酵母菌總數計數方法的適用性試驗回收比值

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 大腸埃希菌檢查方法的驗證

按常規法試驗。取1∶10供試液10 mL加至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入1 mL菌數不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌懸液，混勻，置35 ℃培養24 h，按通則1106檢查法檢查，結果見表2。

2.4.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法的驗證

取1∶10的供試液置25 ℃培養2 h，使供試品中的細菌充分恢復但不增殖，作為供試液。另制成1∶100，1∶1 000的溶液，按常規法試驗。取供試液1∶10，1∶100，1∶1 000各1 mL分別加至10 mL腸道菌增菌液體培養基中，各制成兩份，分別加入不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌懸液1 mL，混勻，置35 ℃培養24 h，按通則1106檢查法檢查，結果見表2。

2.4.3 沙門菌檢查方法的驗證

取供試品10 g加至200 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入不大于100 cfu/mL的沙門菌1 mL，混勻，置35 ℃培養24 h，按通則1106檢查法檢查。以上各控制菌的檢查方法驗證同時制備陰性對照組(除不加菌液及不加供試品外其他同試驗組)、陽性對照組(除不加供試液外同試驗組)、供試品對照組(除不加菌外同試驗組)。檢查結果見表2。

表2 四種醫院制劑控制菌檢查驗證結果

3 討 論

上述結果表明，以上四種院內制劑的需氧菌及真菌、酵母菌計數均可采用平皿法計數，其中腰痹康顆粒及玉夏膠囊需氧菌總數的計數采用1∶10的供試液，各試驗菌株的回收比值均在0.5～2.0內，符合要求。試驗中我們發現，參術健胃膠囊及十七味大活血膠囊1∶10稀釋液在進行需氧菌總數計數時，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收比值均<0.5，應再次對樣品進行稀釋后試驗。因此，在采用1∶20的供試液后各試驗菌株的回收比值均達到了要求。關于驗證時加菌回收率的試驗結果，有實驗研究表明[4]，主要受到兩個方面因素的影響。首先是樣品本身的因素。樣品在檢驗過程中，從前處理到供試液的制備、稀釋、注皿等，其抑菌能力也在不斷地變化，總體上對微生物生長的抑制作用逐漸弱化。其次是操作因素。在試驗操作過程中在加菌樣品分散、稀釋、轉移等過程中造成微生物的損傷而影響回收比值。對于控制菌的驗證，本次試驗中，各試驗組及陽性對照組均呈陽性，供試品對照組、陰性對照組均呈陰性，因此四種醫院制劑均可采用常規法檢驗。

另外，試驗中菌液的檢驗也是一個難點，按照《中國藥典》2015版通則1105的要求，各菌株的接種量均不大于100 cfu。本文中各菌液的最終稀釋級為：金黃色葡萄球菌至10-5，銅綠假單胞菌至10-7，枯草芽孢桿菌至10-3，大腸埃希菌至10-5，沙門菌至10-6，此時按規定培養后的各菌數在50～100 cfu/mL，符合試驗要求。

本研究為上述四種醫院制劑建立了科學可行的微生物限度檢查方法，為后期制劑的檢驗提供了可靠依據。