基于網絡藥理學的金銀花抗炎作用機制研究

楊娟，于曉濤，郭麗娜，王單單，吳作敏，王瑞

(漯河市中心醫院，河南 漯河 462300)

“金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花又名忍冬花(LonicerajaponicaThunb) ，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]。 金銀花自古被譽為清熱解毒的良藥。其性甘寒、氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達又可祛邪。金銀花既能宣散風熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，如身熱、發疹、發癍、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥，均效果顯著。藥理學研究表明，金銀花具有抗炎[2]、解熱、調節免疫功能、利膽、保肝、降血脂、降糖、抗血小板凝聚等生物活性[3]。但是，關于金銀花抗炎的作用機制研究較多地停留在整體動物指標層面[4]，應用網絡藥理學方法的研究較少。不同于化學藥通常作用于單一靶點，中醫藥的治療作用體現在對疾病的辨證施治，強調整體性，體現了中藥多成分-多靶點-多途徑作用的理念[5]。由于中藥的作用機制較復雜，所以深入研究存在較大困難，而通過網絡藥理學可將藥物多成分、多靶點、多通路的關系展現出來，從而為探究活性化合物與其作用靶點之間的相互關系提供更好的方法[6]。本研究旨在尋找金銀花中成藥性、口服吸收較好的抗炎成分，并預測這些成分的抗炎作用靶點及相關通路，為金銀花抗炎作用的深入研究提供參考。

1 方法

1.1 篩選金銀花活性成分

通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)提取金銀花的有關化學成分236個。在此基礎上以OB≥20%(Oral Bioavailability，口服生物利用度)和DL≥0.1(Drug-Like，類藥性)為條件對金銀花活性成分進行篩選[7]，結合文獻報道共獲得40個活性成分。

1.2 金銀花活性成分作用靶點篩選及“成分-靶點”網絡圖構建

通過TCMSP在線數據庫將40個活性成分的作用靶點提取出來，并通過UniProt數據庫以原則為物種為人(Human)作為前提對靶點數據進一步確認。將金銀花的活性成分與相關預測靶點導入Cytoscape3.7構建金銀花“成分-靶點”的網絡圖，再通過Network Analyzer插件分析以上網絡圖研究金銀花活性成分和作用靶點的相互作用關系，以便尋找其活性成分與抗炎相關靶點[8]。

1.3 抗炎相關靶點搜集

Therapeutic Target Database(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)能提供可用作治療的蛋白靶點和核苷酸靶點信息[9]，利用TTD在線數據庫平臺，把“anti-inflammatory”作為篩選條件，提取與抗炎相關的作用靶點。

1.4 抗炎相關靶點確認并構建成分靶點和抗炎靶點的PPI網絡圖

將TTD中得到的靶點輸入String數據庫[10]中預測靶點與靶點之間的相互作用關系，并選取分值>0.4作為蛋白之間相互作用的置信度依據。將結果輸入Cytoscape3.7中構建抗炎靶點蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡。通過 Cytoscape3.7中Merge功能將化合物-預測靶點網絡與抗炎的 PPI 網絡合并，并通過構建的抗炎靶點網絡系統分析金銀花抗炎的靶點。

1.5 KEGG通路富集分析

獲取的抗炎靶點利用DAVID數據庫[11]進行KEGG通路富集分析，并以P≤0.05作為顯著功能與通路的臨界值。再通過Cytoscape3.7軟件構建金銀花抗炎作用活性成分-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 金銀花主要活性成分篩選

通過TCMSP在線數據庫提取的金銀花符合OB≥20%和DL≥0.1的活性成分有55個，再根據文獻報道選取其中40個有相關靶點的主要活性成分作為研究目標，見表1。

2.2 構建金銀花“活性成分-預測靶點”網絡圖

金銀花活性成分-預測靶點網絡(圖1)中共包括263個節點(40個化合物節點與223個靶點節點)，組成了600條邊，表示活性成分與靶點的相互作用關系。體現了金銀花多成分、多靶點共同作用的機制。圖中節點的大小表示度的大小，其中c40(槲皮素，quercetin)的度最大，有145個靶點，為網絡的中心節點。其次重要的活性成分有芹黃素、山柰酚、毛地黃黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇等。

2.3 篩選抗炎靶點并構建化合物-抗炎靶點網絡圖

通過TTD檢測到9個與抗炎相關的蛋白，其PPI網絡(圖2)中，共有7個相互作用靶點，組成7條相互作用關系。使用 Cytoscape3.7 merge 功能將活性成分-預測靶點網絡與抗炎靶點的 PPI 網絡融合，取其交集部分，如圖3所示。可觀察到金銀花中和抗炎有關的活性成分有7種，作用的主要靶點為有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK14)、E-選擇素(SELE)、表皮生長因子受體(EGFR)、受體酪氨酸蛋白激酶erbb-2(ERBB2)。其中金圣草(黃)素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黃黃酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。

2.4 KEGG通路富集分析和金銀花活性成分-靶點-通路網絡的建立

通過DAVID平臺對所得7個金銀花抗炎靶蛋白進行KEGG通路富集分析，以P≤0.05為條件篩選出18條信號通路，見表2。其中炎癥信號通路有TNF signaling pathway；免疫信號通路有hepatitis C、epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection；細胞增殖信號通路有ErbB signaling pathway、MAPK signaling pathway；低氧細胞應激信號通路有HIF-1 signaling pathway；激素信號通路有GnRH signaling pathway；癌癥信號通路有proteoglycans in cancer、bladder cancer、endometrial cancer、non-small cell lung cancer、central carbon metabolism in cancer、pancreatic cancer、Prostate cancer。

通過Cytoscape3.7軟件將活性成分-抗炎靶點與靶點-通路網絡融合，見圖4，可顯示出金銀花抗炎活性成分與靶點以及相關通路之間的關系。挑選出與炎癥反應相關的通路，并構建抗炎相關的活性成分-靶點-通路圖，見圖5。由圖5可以看出，金銀花的抗炎作用主要通過靶點MAPK14、SELE、EGFR發揮。槲皮素、毛地黃黃酮為金銀花主要抗炎成分。

圖1 金銀花“活性成分-預測靶點”網絡圖

圖2 抗炎靶點相互作用

圖3 金銀花抗炎活性成分-靶點網絡圖

表2 金銀花抗炎作用靶點KEGG通路

圖4 金銀花抗炎活性成分-靶點-通路圖

圖5 抗炎相關的活性成分-靶點-通路圖

3 討論

炎癥是機體對于刺激的一種防御反應，表現為紅、腫、熱、痛和功能障礙。炎癥，可以是感染引起的感染性炎癥，也可以不是由于感染引起的非感染性炎癥。近年來，關于濫用抗炎藥所造成的抗藥、并發癥等問題也被頻繁報道。炎癥反應是一個復雜的過程，涉及到多基因與信號通路，而中藥主要是通過多成分、多途徑、多靶點的協同作用來獲得治療效果，由于療效顯著且副作用小的優點在炎癥的治療方面備受關注。

金銀花主要化學成分為有機酸類、揮發油類、黃酮類、環烯醚萜類、三萜及三萜皂苷類和微量元素，自古被譽為清熱解毒的良藥。其性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達又可祛邪。金銀花既能宣散風熱，還善清解血毒，用于各種熱性病，為治一切內癰外癰之要藥。從現代醫學的角度上來講，癰即是致病菌入侵在局部引起的炎癥反應。關于金銀花的抗炎作用，除了關于其含有的綠原酸、總黃酮類的抗炎作用多有報道外，各種文獻報道多從其總提取物的抗炎活性方面進行討論[12-14]。而本研究通過對獲得的金銀花的40種具有生物活性的化學成分進行分析，結果顯示金銀花中的金圣草(黃)素、山柰酚、槲皮素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮、毛地黃黃酮顯示抗炎活性，揭示了金銀花發揮抗炎作用的主要成分。這些抗炎活性成分的主要作用靶點為MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2、TNFRSF1A等。金銀花中的抗炎活性成分可直接作用于 MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2發揮抗炎作用，也可間接作用于其他靶點而發揮抗炎作用。其中金圣草(黃)素、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)鉻酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羥基-7-甲氧基-鉻酮、麥黃酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黃黃酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。結合圖1和圖5可看出毛地黃黃酮、槲皮素是金銀花中OB和DL較高的主要抗炎活性成分，而MAPK14是金銀花發揮抗炎作用的主要靶點。金銀花主要通過TNF signaling pathway、MAPK signaling pathway兩條信號通路發揮抗炎作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組能被不同的細胞外刺激，如細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。這些MAPK能被多種炎性刺激所激活 ,并對炎癥的發生、發展起重要調控作用。EGFR是表皮生長因子(EGF)受體，同時也是 TGF-α受體。E-選擇素是一種細胞表面糖蛋白，能夠介導細胞與細胞、細胞與胞外基質相互黏附。E-選擇素的表達是啟動炎癥反應的關鍵步驟之一。ERBB2(又名ErbB2, NEU, CD340)是原癌基因erbB-2編碼的185 kDa的細胞膜受體，為表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)家族成員之一。ERBB2高表達腫瘤細胞中Ras-MAPK和PI3K-Akt信號傳導活性較高，細胞增殖能力較強，分化成熟和凋亡機制受到抑制，細胞惡性程度高。結合靶點與通路分析，可看出金銀花中抗炎活性成分可能通過以下4種方式發揮抗炎作用：減少促炎細胞因子的產生、阻斷促炎因子與相應受體的結合、抑制啟動炎癥反應的關鍵蛋白的表達、調控細胞增殖從而間接調控炎癥反應。

本實驗通過網絡藥理學的方法顯示出金銀花“多成分-多靶點-多通路”的抗炎作用機制，成功地預測了金銀花抗炎作用的主要成分、主要作用靶點與相關的信號通路，但研究結果仍需要通過進一步的實驗加以驗證。