均勻設計法優選山茱萸九蒸九曬炮制工藝

馬彥江，陳天朝，魯靜，于蘭蘭，王嬌，姚超，牛曉靜*

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2.河南省直第三人民醫院，河南 鄭州 450006；3.駐馬店市中醫院，河南 駐馬店463000；4.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉[1]，最早收載于《神農本草經》，其味酸、澀，微溫，歸肝、腎經，具有補益肝腎、收澀固脫的功效，臨床常用于眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內熱消渴等證，現代藥理研究其具有抗心律失常、降血糖、保肝、抗氧化、抗衰老、調節免疫等作用[2-4]。

九蒸九曬指采用蒸法和曬法反復炮制中藥材，具體細節因藥材品種不同而不同，主要目的是糾偏藥材藥性或增加藥效成分。傳統的九蒸九曬品種主要有何首烏、地黃、黃精、黑芝麻等[5]，九蒸九曬后均具增強補益的作用。鑒于酒炙后的山茱萸也增強了補益肝腎作用[6]，國家級非物質文化傳人朱清山依據自己多年經驗開發出九蒸九曬山茱萸，但炮制技藝局限于個人經驗，缺乏客觀可控的參數?；谥兴幘哂卸喑煞?、多靶點的作用特點，因此本實驗以水浸出物、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷、多糖的含量為指標，運用均勻設計法，考察黃酒用量、燜潤時間、蒸制時間和蒸制次數等工藝參數，以期得到九蒸九曬山茱萸最佳炮制工藝。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Thermo Evolution 201紫外分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)；UltiMate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Hk250型科導臺式超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)；LXJ-IIB型離心機(上海安亭科學儀器廠)；FW-500型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 材料

5-HMF(批號：A22J7L166074，質量分數≥98%),馬錢苷(批號：R23D7F27552，質量分數≥98%)，D(+)﹣無水葡萄糖對照品(批號：S08J6G1，質量分數≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；莫諾苷(批號：17051604，質量分數≥98%，成都普菲德生物技術有限公司)；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；黃酒(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司)；其他試劑均為分析純。

山茱萸(批號:1702091，安徽普仁中藥飲片有限公司)，經河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部陳天朝主任藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉。

2 方法與結果

2.1 水浸出物測定

山茱萸水浸出物含量按照《中國藥典》2015年版四部通則2201項下水溶性浸出物測定法的冷浸法測定。

2.2 5-HMF、莫諾苷、馬錢苷的測定

2.2.1 色譜條件

采用Agilent 公司Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，7%A；20～50 min，7～20%A)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。5-HMF、莫諾苷和馬錢苷混合對照品及山茱萸九制品的HPLC色譜圖見圖1。結果表明，樣品中的其他成分不干擾5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的測定。

2.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的對照品適量，用80%甲醇配成濃度分別為1.505、0.510和0.505 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱定均勻試驗樣品(1～8號)約0.2 g，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，回流1 h，放涼，再稱重，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即可。

2.2.4 標準曲線的繪制

分別精密吸取對照品儲備液1、2、4、6、8、10 mL，置于6個50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，配制成一系列濃度的標準溶液，進樣測定，以對照品的濃度(C)為橫坐標，以峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(6號樣品)10 μL，連續進樣6次，測得5-HMF、莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為0.8%，0.6%和0.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液(6號樣品)，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，記錄峰面積。結果5-HMF、莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為1.1%，1.4%和1.2%，表明供試品溶液中3種成分在24 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗

取同一供試品溶液(6號樣品)，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得到樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢苷含量的平均值分別為2.12%，0.66%和0.76%，RSD分別為1.3%，1.0%和1.1%，結果表明，該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取山茱萸樣品(6號樣品)1 g，共6份，分別加入對照品儲備液1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的平均回收率分別為98.1%，97.3%和98.9%，RSD分別為3.15%，2.23%和2.86%，結果表明，該方法的回收率較好。

圖1 5-HMF、莫諾苷和馬錢苷混合對照、山茱萸九制HPLC色譜圖

2.2.9 樣品含量測定

取均勻試驗樣品(1～8號)，按“2.2.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中5-HMF、莫諾苷和馬錢苷的含量。

2.3 多糖的含量測定

2.3.1 0.1%蒽酮硫酸溶液的配制

準確稱取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸溶液100 mL，使溶解，即得，現用現配。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻，制成每1 mL含0.107 mg的葡萄糖溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱定均勻試驗樣品(1～8號)約2 g，加8倍量95%乙醇，回流8 h脫脂，藥渣揮干，用20倍量蒸餾水在80 ℃回流提取2.5 h，趁熱過濾，提取2次，合并濾液，定容至100 mL，取水煎液10 mL，加入4倍量無水乙醇，4 ℃放置過夜，離心，棄去上清液，沉淀用水溶解，轉移并定容至100 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.4 標準曲線的繪制

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞刻度試管，加水至2 mL，搖勻，迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15 min，取出，以相應的試劑為空白，在625 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標，以吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線為：A=11.279C+0.020 6(R2=0.999 1)，結果顯示吸光度與無水葡萄糖在0.010 7～0.064 2 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗

精確吸取同一供試品溶液(6號樣品)2 mL，按照上述蒽酮硫酸法顯色，并測定吸光度，重復平行實驗6次，記錄吸光度，得到RSD為0.37%，結果表明，該儀器的精密度好。

2.3.6 穩定性試驗

精確吸取同一供試品溶液(6號樣品)2 mL，按上述蒽酮硫酸法顯色，并測定吸光度，每隔10 min測定1次，60 min內RSD為0.69%，結果表明，該供試品溶液在60 min內的穩定性較好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密稱取山茱萸樣品(6號樣品)1 g，共6份，分別精密加入葡萄糖對照品溶液(17.39 mg/mL)1 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述蒽酮硫酸法顯色并測定吸光度，多糖的平均回收率為97.3%，RSD為4.23%，結果顯示，證明該方法的回收率較好。

2.3.8 樣品含量測定

精密量取供試品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度試管，搖勻，迅速精密加入新配制的0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混勻后于沸水浴中加熱15 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15 min，取出，在625 nm處測定吸光度。根據標準曲線計算供試品溶液中多糖含量。

2.4 均勻試驗設計

表2 因素水平表

表3 均勻設計試驗及結果

利用SPSS 22.0對試驗數據進行二次多項式回歸分析處理，得到回歸方程為：Y=49.961+18.314X3+6.249X4-3.131X3X4，R=0.954，P=0.015<0.05，表明回歸方程擬合度高，且具有統計學意義。X3與X4存在交互作用。X3X4的系數為負值，說明各指標成分提取率呈負相關；X3，X4的系數為正值，說明其與各指標成分提取率呈正相關。

根據回歸方程，可得山茱萸最佳九蒸九曬工藝為黃酒用量15%、燜潤時間1.5 h、蒸制時間1.5 h、蒸制次數9次。

3 工藝驗證

取山茱萸100 g，共3份，按照“2.5”項下所得到的最佳工藝條件進行驗證試驗，對山茱萸九制品中有效成分的含量進行測定，結果見表4。結果表明，優選的工藝穩定、可行。

表4 工藝驗證結果

4 討論

九蒸九曬作為中藥特色炮制技術，具有悠久的歷史和深厚的文化底蘊。始見于唐朝孟詵的《食療本草》，其中記載了九蒸九曬黃精的炮制方法及功效。經后世歷代醫藥學家發揚光大，九蒸九曬的中藥品種逐步增加，炮制工藝和輔料選擇進一步細化。早在清朝時期，河南省禹州趙隆太藥行的九蒸九曬地黃就在柏林的“萬國博覽會”上獲得金獎，被稱為“隆熟地”，但后因多種原因九蒸九制九蒸九曬工藝失傳。2006年，國家級非物質文化傳人、老藥工朱清山先生依據自己多年經驗成復制出“黑如漆、光如油、甘如飴”的古法九蒸九曬熟地，并在此基礎上開發出九蒸九曬槐角、山茱萸等品種。但受歷史條件、認知能力及科學水平的限制，目前可參照的九蒸九制炮制工藝仍以來經驗判別，且工藝繁瑣、效率低下，缺乏客觀可控的參數，質量控制點僅憑外觀性狀、口感等傳統經驗，缺乏數字化、標準化的炮制工藝標準。隨著“健康中國”戰略的實施和民眾對養生的重視，古法炮制中藥迎來了發展的春天，傳統經驗炮制工藝技術已不能滿足市場需求和食藥監管的要求。因此，建立數字化、標準化的九蒸九曬炮制工藝，對中醫藥文化的傳播、中藥炮制技術的傳承、古法炮制中藥飲片的品牌樹立具有重要意義。

山茱萸富含酯類、五環三萜類、鞣質和多糖等活性成分。研究發現莫諾苷具有神經保護作用[7-9]，馬錢苷具有免疫調節、抗休克、抗過氧化等作用[10]，2015年版《中國藥典》也把環烯醚萜苷類化合物莫諾苷和馬錢苷作為山茱萸的定量指標。研究發現山茱萸多糖具有提高免疫、抗炎、抗衰老和抗氧化、提高骨髓造血及抗腫瘤細胞的作用[11]，是其補益肝腎的主要物質基礎；5-HMF是中藥炮制加熱過程中發生的美拉德反應的典型產物，是炮制程度的指標性成分，也是山茱萸炮制后補益肝腎作用增強的物質基礎之一[11-15]?；谥兴幘哂小罢w性、多靶點、協同性”的特點，故本試驗選擇水浸出物、莫諾苷、馬錢苷、5-HMF和多糖的含量作為綜合評價指標進行炮制工藝研究。

本實驗研究發現黃酒用量、蒸制時間、蒸制次數3個因素間存在交互作用，與傳統炮制經驗相符。經過試驗，最終優選出九蒸九曬山茱萸的最佳工藝為黃酒用量15%、燜潤時間1.5 h、蒸制時間1.5 h、蒸制次數9次。驗證實驗證實該方法穩定、可行，將為九蒸九曬山茱萸炮制工藝研究和炮制品質量評價提供了數據支撐。