PCPA失眠大鼠腦干NG2細胞和NMDA受體的表達及酸棗仁湯的干預作用

郭海波，全 睿，滕 柳，石 鵬，王 慧

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002)

睡眠與膠質細胞關系密切[1]。NG2細胞作為新型膠質細胞[2]，被認為是一種動態的前體膠質細胞群，它在體內不斷分化和遷移，在大腦不同區域及不同發育時間廣泛存在。它與神經元之間形成突觸聯系[3]，參與突觸可塑性和調節、支持、營養神經元[4]，在神經信息傳遞中起著重要作用。睡眠不足可以影響髓鞘形成相關基因的表達，而NG2細胞作為少突膠質細胞前體細胞，也受到睡眠的調節和影響[5]。

對氯苯丙氨酸(P-chlorophenylalanine，PCPA)作為五羥色胺合成酶——色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)的拮抗劑，能夠阻斷腦內五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)合成，減少腦內5-HT含量，使動物出現失眠。利用PCPA建立失眠動物模型，因效果確切、操作方便受到諸多學者的青睞[6]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是興奮性氨基酸——谷氨酸(Glutamate，Glu)的離子型受體，它在中樞神經系統(Central Nervous System，CNS)表達廣泛，調控突觸可塑性和神經元長時程增強效應[7]，與學習記憶關系密切，對生物發育過程極為重要[8]。在神經退行性疾病、腦缺血等發生機制中也起到重要作用[9]。有研究顯示NMDA受體功能低下可導致小鼠睡眠-覺醒障礙，晝夜節律延長，入睡延遲[10]；還有研究顯示，睡眠剝奪可導致腦扣帶回前部NMDA受體亞基表達水平顯著上調[11]。酸棗仁湯(Suanzaoren Decoction，SZRD)是中國漢代著名醫家張仲景的經典方劑，現代研究顯示酸棗仁湯治療失眠的機制與調控腦內神經遞質水平和抑制膠質細胞激活有關[12]，但酸棗仁湯干預失眠的機制是否與NG2細胞和NMDA受體相關，目前尚不清楚。本研究探討PCPA導致的失眠經酸棗仁湯治療后腦干NG2細胞和NMDA受體表達的變化，旨在進一步揭示酸棗仁湯治療失眠的可能機制。

1 材料與試劑

1.1 動物

健康SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠50只，體重(200±20)g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號NO.SCXK(湘)2014-0011。在安靜、自然光、溫度保持恒定(22±2)℃的環境中隨意獲取食物和水，飼養7天后進入實驗。飼養和實驗條件均符合貴州中醫藥大學動物倫理和實驗相關要求。

1.2 器材、試劑和藥物

7500實時熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司)；NP80超微量分光光度計(德國Implen公司)；PCPA(C-6506，Sigama公司)；中藥材(酸棗仁、知母、茯苓、川芎、炙甘草)購自北京同仁堂貴陽藥店。Trizol(Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(賽默飛世爾科技有限公司)，qPCR引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 藥物制備

SZRD處方參照《方劑學》第5版教材：酸棗仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，炙甘草3 g組成。稱取以上五味藥材10劑共460 g，加8倍量水，浸泡1 h后煎煮1 h，沸后30 min紗布濾過。藥渣加6倍水煎煮，沸后20 min紗布濾過，合并兩次濾液，濃縮成150%濃度(含生藥量15 g/mL)的水提物，分裝滅菌，4 ℃冰箱儲存備用[12]。

PCPA溶液制備：將PCPA按照350 mg/kg計算總用量，稱量PCPA粉末，倒進滅菌后的研缽內，加少量生理鹽水研磨30 min，邊研磨邊加水，直至達到所需濃度。將PCPA懸浮液收集至試劑瓶，冰箱4 ℃保存備用[6]。

2.2 分組、給藥方法和造模

隨機分為5組：正常組、對照組、PCPA組、SZRD組、PCPA+SZRD組，每組10只。正常組不給任何處理；對照組腹腔注射生理鹽水；PCPA組和PCPA+SZRD組腹腔注射PCPA 350 mg/kg，SZRD組腹腔注射等體積的生理鹽水。腹腔注射均為每天1次連續6天。第7天開始，正常組不做處理，對照組和PCPA組灌胃生理鹽水，SZRD組和PCPA+SZRD組灌胃SZRD。酸棗仁湯灌胃按照7.5 g/kg以10 mL/kg體積，每天1次，連續8天。8天后取材進行RT-PCR檢測。腹腔注射PCPA 3天后可見大鼠晝夜節律消失，白天活動增加，皮毛無光澤及脫毛增加，體重增長緩慢，攻擊性增強等，整體觀察和對照組形成鮮明對比，表明失眠模型復制成功。

2.3 取材

大鼠在末次給藥2 h后腹腔注射苯巴比妥1.25 mg/kg麻醉后，于冰上快速取出腦組織，分離腦干，迅速將腦干置于4%多聚甲醛標本瓶中，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

2.4 引物設計

應用引物設計軟件Primer 5.0設計RT-PCR所需相關特異性引物，交由上海生工生物技術服務有限公司合成，見表1。

表1 引物序列和片段大小

2.5 總RNA的提取，cDNA的合成和反應條件

Trizol法提取總RNA，用NP80超微量分光光度計測定、計算RNA純度和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0為純度合格，總RNA置于-80 ℃保存備用。根據RNA濃度計算逆轉錄加入量，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄操作，得到cDNA，-20 ℃保存備用。總體積采用20μL反應體系進行擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參基因，反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。試驗樣品每組做3個重復。

2.6 統計學處理

3 結果

結果顯示(見表2)，與對照組比較，PCPA組NG2 mRNA的表達升高(P<0.05)，NMDA受體mRNA的表達顯著升高(P<0.01)，5-HT1A受體mRNA表達下降(P<0.05)，差異有統計學意義。與PCPA組比較，PCPA+SZRD組NG2細胞、NMDA受體mRNA的表達下降(P<0.05)，5-HT1A受體mRNA的表達升高(P<0.05)，差異有統計學意義。正常組NG2、NMDA受體、5-HT1A受體表達量和對照組比較無統計學意義(P>0.05)。

分組例數(n)NG2NMDAR5-HT1AR正常組100.946±0.1190.995±0.1051.614±0.337對照組100.995±0.1561.065±0.1591.715±0.279PCPA組101.315±0.051?1.638±0.081??1.230±0.135?SZRD組101.004±0.1301.277±0.1171.722±0.118PCPA+SZRD組101.107±0.023#1.362±0.154#1.627±0.109#

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。與PCPA組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

5-HT是腦內最重要的單胺類神經遞質，與睡眠關系密切。PCPA通過拮抗色氨酸羥基化而阻斷和耗竭腦內5-HT的合成[13]，進而導致失眠。本實驗采用腹腔注射PCPA成功制作大鼠失眠模型，觀察了SZRD對失眠大鼠腦干NG2、NMDA受體的表達，以及與睡眠最密切的5-HT受體亞型之一：5-HT1A受體的變化。結果顯示，腹腔注射PCPA后，失眠大鼠腦干NG2、NMDA表達升高，5-HT1A表達下降。SZRD治療后，NG2、NMDA受體表達下降，5-HT1A表達升高。而對照組與正常組無顯著差異，說明SZRD對正常大鼠腦干NG2、5-HT1A、NMDA受體無明顯作用。

目前所知，所有的動物都需要睡眠[14]，睡眠障礙可導致不良后果，其重要性無需多言，但睡眠對NG2細胞的影響目前知之甚少。NG2細胞被認為是存在于CNS的第四個膠質細胞群[2]，它與神經元之間存在著經典或非經典的突觸聯系。腦干網狀結構的Glu能系統參與了覺醒的發生。在新生鼠和成年小鼠海馬切片中發現存在著神經元-NG2細胞的Glu能突觸[15]。Glu在CNS中的作用主要是通過其受體介導。Glu受體分為兩類：離子型受體和代謝型受體。NMDA受體屬于離子型受體，主要作用是參與生理狀態下的突觸可塑性和病理狀態下的興奮性毒性[16]。NG2細胞可表達多種Glu受體，其中就包括NMDA受體[17]。研究顯示，NMDA受體與睡眠關系密切，它被阻滯后可影響睡眠[18]，而睡眠障礙也可以影響NMDA受體的表達[19]。NMDA還是5-HT1A、2A、2C受體的重要靶標[20-21]，有研究顯示通過與NMDA相互作用，不同的5-HT受體亞型調節前額皮質神經元放電存在著差異，5-HT受體對興奮性的復雜效應被選擇性改變[22]。5-HT和NMDA受體的信號傳導均參與了大腦的認知和情緒的調節，這通常與焦慮、失眠和抑郁等精神障礙相關。大鼠腹腔注射PCPA導致腦內5-HT濃度下降以后腦干NG2和NMDA受體表達增加，極有可能與離子通道信號轉導有關。本課題組以往研究表明，PCPA導致的失眠可使大鼠大腦微透析液中的Glu含量升高[23]，Glu的大量升高會過度激活突觸后NMDA受體，使其表達增加，NMDA受體表達增加可導致離子通道開放，產生Ca2+內流，以此影響神經細胞信號的轉導，參與大腦認知和情緒調節。NG2細胞可以通過所表達的受體對相關神經信號作出反應，進而參與睡眠剝奪的過程。但5-HT合成減少后NG2信號傳遞的機制仍需要進一步明確。

有研究顯示，NG2細胞不僅可以作為少突膠質細胞前體細胞參與髓鞘的形成和損傷的修復[24]，同時與CNS損傷，如脫髓鞘、外傷、缺血和膠質瘤形成等病理狀態密切相關[25]；但NG2細胞仍不同于少突膠質細胞，二者對應激反應的基因表達有著明顯的區域特異性[26]。成人NG2細胞在機械損傷、興奮性毒性和病毒感染等其它CNS損傷后也可被激活和增殖[27]，神經/膠質抗原2(NG2)還是病理狀態下周圍細胞活化的早期標志[28]，在神經受損后，NG2細胞的增殖能力迅速增加并向組織損傷區域遷移[29]，作為關鍵成分在損傷神經周圍形成高阻抗膠質瘢痕，在神經損傷修復中發揮著積極作用。有研究顯示，睡眠不足可以抑制髓鞘形成相關基因的表達[30]，對NG2細胞的分化和增值有著不同影響[31-32]。PCPA導致睡眠剝奪后NG2細胞表達增加，可能還與NG2細胞對應激的高度反應性相關，因其功能之一就是響應CNS的損傷在神經系統穩態中發揮作用。

綜上所述，PCPA導致的失眠可引起大鼠腦干NG2細胞和NMDA受體表達增加，酸棗仁湯干預后，NG2細胞和NMDA受體表達下降，這有可能是酸棗仁湯治療失眠的靶點之一，從而進一步揭示了酸棗仁湯治療失眠的潛在機制。利用現代藥理學方法對中藥復方的作用機制進行研究有助于我們深入、系統地了解中藥復方的藥效基礎和作用機理，可以有效促進中醫藥現代化。