熊果酸對CIA大鼠關節軟組織RANKL、RANK、OPG mRNA表達的影響

周 儉，曾 光*，鮮瑤瑤，劉沙

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.漯河市中心醫院，河南 漯河 462300)

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以掌指關節、近端指間關節及腕關節為主的對稱性、小關節腫痛為臨床表現的系統性疾病，在RA患者的活動期甚至伴有胸膜炎、間質性肺炎、肝脾大等累及其他系統疾病，病情控制欠佳患者后期可出現關節損傷伴隨功能受限。RA的診療目的主要為控制炎癥，減輕患者關節疼痛狀態、防止關節破壞等。若RA病情未能及時控制時，則會出現關節畸形、活動受限等不可逆的損害。故類風濕關節炎骨保護是目前治療類風濕關節炎的重要目標。熊果酸(ursolic acid，UA)，化學名3β-羥基-熊果-12-烯-28-甲酸(3β-hydroxyurs-12-env28-oic acid)，是非極性的五環三菇酸，其廣泛存在于植物界中，與藥用植物如梔子、連翹、山茱萸、白花蛇舌草等同樣分布廣泛[1-2]，不僅能抑制癌細胞生長，誘導癌細胞凋亡等抗癌作用，在抗心血管疾病、恢復肝功能等同樣起著重要作用[3-5]，在過去的數年里，越來越多的研究表明UA具有一定的骨保護作用[6]。

RA的骨破壞機制復雜，細胞核因子κB受體活化因子配體(Nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand，RANKL)/細胞核因子κB受體活化因子(Nuclear factorκB receptor activating factor，RANK)/骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)通路在RA的關節研究中起著重要作用。為進一步探討UA的骨保護作用，本實驗以膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠為模型，觀察熊果酸對 CIA大鼠關節軟組織RANKL、RANK、OPG mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠(購于斯萊克景達公司)，8周齡，雌性，體質量(120±10)g，SPF級實驗室正常飼養1周后實驗。

1.1.2 試劑 牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex)；弗氏不完全佐劑(Sigma)；熊果酸標準品(純度98%)，Delta標準品公司提供；甲氨蝶呤片，規格：2.5 mg，上海信誼藥廠有限公司生產。大鼠RANKL、RANK、OPG引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 實驗儀器 7500PCR儀(美國 ABI)；T10 basic勻漿機(德國 IKA)。

1.2 方法

1.2.1 造模與評估 取70只雌性SD大鼠。隨機選取10只作為空白對照組，其余大鼠均復制CIA模型[7]。

1.2.2 關節炎指數(AI)評分 用關節炎指數(AI)作為判斷模型是否成功的標準。肢體關節腫脹按0～Ⅳ級評分：0，無紅腫；Ⅰ，趾關節稍腫；Ⅱ，趾關節及足趾關節腫脹；Ⅲ，踝關節以下足爪腫脹；Ⅳ，包括踝關節在內的全部足爪腫脹。AI值=四肢肢體關節腫脹級評分之和(Ⅰ級為1分，總分為16分)。AI≥4分為造模成功，本次成功率約為70%。

1.2.3 分組與給藥 將造模成功的CIA大鼠隨機分為CIA模型組(CIA)、熊果酸低劑量組(50 mg/kg)、熊果酸高劑量組(100 mg/kg)、甲氨蝶呤組(MTX)、熊果酸+甲氨蝶呤組(UA+MTX)，每組各6只。在初次免疫12d起，熊果酸組給予熊果酸灌胃(分別為50 mg/kg/d和100 mg/kg/d)，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤(0.9 mg/kg/w)灌胃，熊果酸聯合甲氨蝶呤組給予熊果酸(50 mg/kg/d)加上甲氨蝶呤(0.9 mg/kg/w)灌胃，空白組和CIA模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃，于初次免疫30 d，斷頸處死大鼠，取炎癥關節進行研究。

1.3 指標檢測

1.3.1 檢測大鼠關節軟組織RANKL、RANK、OPG mRNA表達檢測 于初次免疫 30 d，取大鼠炎癥關節，組織勻漿，按說明書提取各組 RNA。使用 Nanodrop2000690檢測RNA濃度及純度，將濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，使其終濃度為 500 ng/μL。按照 RTRCR試劑盒說明書將RNA反轉錄合成 cDNA，各引物序列見表1。取上述反應產物2.0 μLcDNA。配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管：2×qPCR Mix 12.5 μL；上游引物2.0 μL；下游2.5 μL；ddH208.0 μL。反應條件：預變性：95 ℃10 min；循環(40次)95 ℃15 s→60 ℃60 s；熔解曲線，65 ℃→95 ℃，每 15 s升溫 0.3 ℃。在美國ABI7500熒光定量擴增儀上完成熒光實時監測PCR擴增，作出溶解曲線，收集熒光得到的曲線圖，用實時熒光定量PCR分析程序分析。ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內標基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內標基因，對照樣本)，K=A-B(mean)，表達水平以 2-ΔΔCT表示。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 PCR分析結果

各組關節軟組織中RANKL、RANK、OPG陽性表達的平均灰度值比較見表2。由表2可見，與空白組對比，模型組的RANKL、OPG mRNA表達明顯上調(P<0.01)，與模型組相比，甲氨蝶呤組、熊果酸+甲氨蝶呤組中RANKL mRNA表達明顯降低(P<0.01)，熊果酸高劑量組RANKL mRNA表達降低(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，熊果酸+甲氨蝶呤組中RANKL mRNA表達降低(P<0.05)。

組別RANKRANKLOPG空白1.64±0.121.30±0.27◆◆1.66±0.14◆◆CIA模型組1.99±0.342.00±0.162.31±0.28熊果酸(UA50mg/kg)2.04±0.211.74±0.172.41±0.19熊果酸(UA100mg/kg)2.05±0.361.62±0.19◆2.22±0.20甲氨蝶呤(MTX)組2.11±0.151.58±0.09◆◆2.4±0.17UA+MTX組2.19±0.281.42±0.06◆◆△2.29±0.09

注：◆◆P<0.01，◆P<0.05，與模型組比較；△△P<0.01，△P<0.05，與MTX組比較。

3 討論

RA的發病機制復雜，對RA的骨保護作用是防止RA關節損害新的研究重點。RA發病機制是由多種細胞及細胞因子共同作用的過程，其中，破骨細胞(osteoclast，OC)的繁殖及激活起著關鍵作用，RANKL/RANK/OPG通路通過對OC增殖過程的調控，從而影響骨保護作用[8]。OC來源于造血干細胞的多核細胞，能溶解骨組織，參與骨破壞。在破骨細胞前體(osteoclast precursors，OCPs)形成OC的過程中，要通過RANKL激活OCPs表面的 RANK受體，從而誘導OCPs形成 OC。RANKL不僅是OCPs分化的激活因子，還可通過刺激OC的繁殖和激活，抑制OC死亡[9]。OPG又叫破骨細胞抑制因子，是一種生長因子受體，能競爭性與RANKL聯合，進而阻斷RANKL與RANK的聯絡，減少OCPs向OC的增殖分化[10]。由此可見，RANKL和 OPG的穩定影響骨代謝，RANKL/OPG比值是骨骼完整性的重要要素[11]。研究表明，RANKL/OPG比率失衡是許多骨骼疾病的病理基礎[12]。相關研究表明，局部病變RANK及OPG比值能影響以OC為介導基礎的骨代謝的穩定，這提示RANKL/OPG比值在RA骨保護中有著重要的影響[13]。

在RA的診療中，急性疼痛期配合使用抗炎止痛藥，系統診療過程包括抗風濕病藥、生物制劑及手術等。中藥治療風濕病歷史悠久，與單純西藥治療RA相比，中藥治療RA在患者病情活動的控制及預后具有一定優勢。協同中藥診治RA不僅能提高臨床療效，并可減輕部分西藥的副作用。中藥可能成為RA骨保護新的研究方向。本項目組前期研究發現，UA是一種有潛力的低毒且高效的生物制劑[14]。本實驗研究了熊果酸對大鼠CIA模型關節軟組織RANKL、RANK、OPG mRNA表達的影響，發現高劑量組的UA對CIA大鼠關節RANKL mRNA表達減低，與單用MTX組比較，UA聯合MTX組大鼠關節RANKL mRNA的表達降低(P<0.05)。因此，UA聯合MTX應用于大鼠關節炎，效果優于單獨應用MTX，由于RANKL/OPG的激活有多種細胞因子參與，UA表現出來的對炎癥關節組織中的RANKL的抑制作用，可能與早期緩解了關節炎癥有關。