3種前處理-HPLC法測定嬰幼兒配方食品中維生素B1

傅紅雪，陳萬勤，劉柱，梁晶晶，周霞，羅金文*

浙江省食品藥品檢驗研究院（杭州 310052）

嬰幼兒配方食品中常添加維生素B1以適應嬰幼兒的營養(yǎng)需求。維生素B1又稱硫胺素，在調(diào)控新陳代謝方面有重要作用[1]，是維持心臟、神經(jīng)及消化系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)的必需物[2]。當人體缺乏維生素B1時，可引起多種神經(jīng)炎癥，患者的周圍神經(jīng)末梢出現(xiàn)發(fā)炎和退化現(xiàn)象，并伴有四肢麻木、肌肉萎縮、心力衰竭、下肢水腫等癥狀[3-4]。嬰幼兒配方乳粉及谷類輔助食品是嬰幼兒除母乳外的重要營養(yǎng)來源，因此維生素B1的添加量對嬰幼兒的身體健康有著重要影響。GB 10765—2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》[5]中規(guī)定，嬰兒配方乳中維生素B1的添加量應在14～72 μg/kJ之間；GB 10767—2010《食品安全國家標準 較大嬰兒和幼兒配方食品》[6]中規(guī)定，較大嬰兒和幼兒配方食品中維生素B1的添加量應≥11 μg/kJ；GB 10769—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒谷類輔助食品》[7]中規(guī)定，嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的添加量應≥12.5 μg/kJ。可見維生素B1含量過高或過低均會對嬰幼兒產(chǎn)生不利影響，尤其是對一段奶粉。因此，建立嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的檢測方法，對維生素B1的使用監(jiān)管尤為重要。

目前對維生素B1的檢測主要有分光光度法[8-9]、高效液相色譜法[10-11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-13]等。其中，液相色譜法是檢測維生素B1常用的方法。GB 5009.84—2016《食品安全國家標準 食品中維生素B1的測定》[14]中規(guī)定了食品中維生素B1的測定方法，先將試樣酸解和過夜酶解，再在堿性條件下衍生，最后利用熒光檢測器檢測。方法總體耗時較長，繁瑣復雜，不適用于實際工作中的批量檢測。何麗姍等[15]在測定嬰幼兒配方乳粉中的維生素B1、B2時，將乳粉調(diào)節(jié)pH以沉淀蛋白質(zhì)，過濾后直接經(jīng)堿性鐵氰化鉀衍生，結(jié)果回收率良好。還有人在流動相中加入離子對試劑或三乙胺[16-17]，利用紫外檢測器測定嬰幼兒奶粉中的維生素B1，回收率良好。

分別采用國標法（GB 5009.84—2016）、酸解法和等電點法處理試樣，優(yōu)化提取劑和流動相配比，采用高效液相色譜-熒光檢測法測定嬰幼兒配方食品中的維生素B1，為嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的測定提供理論基礎(chǔ)和具體方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素B1（純度≥97.0%），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國Merck公司；乙酸鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、鐵氰化鉀（分析純）、正丁醇（分析純）、異丁醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、木瓜蛋白酶（生物試劑）、淀粉酶（生物試劑），購自國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水（超純水），取自Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260型高效液相色譜儀，配備熒光檢測器、安捷倫化學工作站，安捷倫科技有限公司；賽默飛世爾Multifuge X1R型高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司；默克密理博Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)，密理博有限公司；三洋MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，滅菌溫度105～135℃，日本三洋電機公司；梅特勒Seven Excellence型酸度計，精度0.01，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 試樣前處理

1.3.1 國標法

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于100.0 mL錐形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，搖勻后蓋好瓶塞放入高壓滅菌鍋中，在121℃下酸解30 min。用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液，搖勻后置于培養(yǎng)箱中37℃過夜（約16 h）。將酶解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，取上清液，備用。準確移取2.0 mL上清液于10 mL試管中，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后準確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻1 min后以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液于2 mL棕色進樣瓶中，待測。

1.3.2 酸解法

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于100.0 mL錐形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，搖勻后蓋好瓶塞放入高壓滅菌鍋中，在121℃下酸解30 min，冷卻至室溫后取出并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻后過濾，取上清液，備用。準確移取2.0 mL上清液于10 mL試管中，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后準確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻1 min后以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液于2 mL棕色進樣瓶中，待測。

1.3.3 等電點法

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于100.0 mL錐形瓶中，加入60 mL 50℃的水，并在50℃下振搖10 min，取出并超聲10 min，冷卻至室溫。用2.4 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)試樣pH至1.7左右，放置約2 min后，再用2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣pH至4.5左右。轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。搖勻后過濾，取上清液，備用。準確移取2.0 mL上清液于10 mL試管中，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后準確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻1 min后以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液于2 mL棕色進樣瓶中，待測。

1.4 標準溶液的配制和衍生

維生素B1標準儲備液：準確稱取56.1 mg（精確至0.1 mg，相當于50 mg硫胺素）經(jīng)五氧化二磷干燥24 h的鹽酸硫胺素標準品，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至100 mL，搖勻。置于0～4℃冰箱中保存。逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度為3，30，60，150和300 ng/L的標準系列工作液。

取2.0 mL標準系列工作液，加入1.0 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后準確加入2.0 mL正丁醇，再次渦旋混勻1 min后以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液于2 mL棕色進樣瓶中，待測。

1.5 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。柱溫：35℃。檢測器：熒光檢測器。檢測波長：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長435 nm。進樣量：15 μL。流速：1.0 mL/min。流動相：稱取6.80 g乙酸鈉，加水定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水系微孔濾膜過濾后作為流動相A，流動相B為甲醇。流動相配比為A∶B=70∶30。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

維生素B1本身并無熒光性，衍生化后需立即用強極性試劑提取出來并上樣分析，因此提取劑對回收率的影響較大。分別將已知維生素B1本底含量的嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品，加入已知濃度維生素B1，采用酸解法處理試樣，提取劑分別為正丁醇、異丁醇和乙酸乙酯，測定結(jié)果并計算回收率。結(jié)果見表1。由表1可得，當正丁醇作為提取劑時，嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品的回收率均最高。因此選擇正丁醇作為提取劑。

表1 提取劑對回收率的影響

2.2 色譜條件的優(yōu)化

GB 5009.84—2016中采用甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（pH 4.0，35∶65，V/V）來檢測維生素B1。但實際檢測中發(fā)現(xiàn)，當甲醇比例為35%時，柱壓往往過高，影響色譜柱的使用壽命。且配制流動相需調(diào)節(jié)0.05 mol/L乙酸鈉溶液的pH，較為繁瑣且試驗過程中pH波動較大。

因此，分別采用甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（pH 4.0，35∶65，V/V）、甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（35∶65，V/V）、乙腈-0.05 mol/L乙酸鈉（35∶65，V/V）、乙腈-0.05 mol/L乙酸鈉（30∶70，V/V）、甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（30∶70，V/V）作為流動相進行試驗。結(jié)果表明，0.05 mol/L乙酸鈉的加入可使維生素B1的保留時間增加，峰形得到明顯改善；且未調(diào)節(jié)pH時，已經(jīng)能將維生素B1與樣品中的其它水溶性雜質(zhì)分離開來。甲醇和乙腈對峰形影響的區(qū)別不大，考慮到甲醇較乙腈毒性更小且更經(jīng)濟，因此采用甲醇；但甲醇比例為35%時柱壓過高，當降至30%時可明顯降低柱壓，且對峰形無明顯影響。因此，決定采用甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（30∶70，V/V）作為流動相。

按色譜條件對0.607 mg/L維生素B1標準溶液進行測定，其標準溶液色譜圖及嬰幼兒配方奶粉樣品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 維生素B1標準溶液色譜圖

圖2 嬰幼兒配方奶粉樣品色譜圖

2.3 標準曲線和檢出限

按色譜條件對濃度范圍3.036～303.6 ng/mL之間的系列標準溶液進行測定，以儀器響應的峰面積Y對應濃度X（mg/L）進行線性回歸，考察線性關(guān)系，結(jié)果見表2。由表2可得，維生素B1的相關(guān)系數(shù)R2大于0.999，表明該方法在3.036～303.6 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

根據(jù)3倍信噪比得出方法的檢出限（3S/N），為0.008 450 mg/kg，低于GB 5009.84—2016《食品安全國家標準 食品中維生素B1的測定》中規(guī)定的檢出限要求（0.3 mg/kg），完全能滿足分析要求。

表2 線性參數(shù)和檢出限

2.4 精密度和回收試驗

分別將已知維生素B1本底含量的嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品，加入低中高三個濃度水平的維生素B1標準溶液，每個濃度平行6組，分別采用國標法、酸解法和等電點法處理試樣，計算回收率及其RSD值。其中，嬰幼兒配方乳粉的本底含量為3.60 mg/kg，嬰幼兒谷類輔助食品的本底含量為2.57 mg/kg。結(jié)果見表3。

由表3可得，國標法處理的嬰幼兒配方乳粉及谷類輔助食品的維生素B1回收率在94.4%～98.4%范圍內(nèi)，回收率的RSD為0.961%～1.98%（n=6）。酸解法處理的嬰幼兒配方乳粉及谷類輔助食品的維生素B1回收率在96.0%～99.2%范圍內(nèi)，回收率的RSD為0.749%～ 1.92%（n=6）。等電點法處理的嬰幼兒配方乳粉及谷類輔助食品的維生素B1回收率在95.6%～97.1%范圍內(nèi)，回收率的RSD為1.41%～4.20%（n=6）。3種方法的準確度和精密度良好，均滿足嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的測定。其中，國標法和酸解法的RSD值相對較小，等電點法的RSD值偏大。可見，國標法和酸解法優(yōu)于等電點法。

2.5 樣品分析

分別采用國標法、酸解法和等電點法處理試樣，對市售的18種嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品進行分析，結(jié)果見表4。由表4可得，大部分的嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品都可以采用3種方法測定維生素B1。試樣經(jīng)國標法、酸解法處理測得維生素B1含量與標簽一致。經(jīng)等電點法處理測得維生素B1含量多數(shù)比國標法和酸解法高，原因考慮是國標法和酸解法均要在高溫下酸解30 min，可能導致維生素B1產(chǎn)生變化。只有少數(shù)試樣（二段奶粉1號和嬰幼兒面條1號）經(jīng)等電點法處理后測得維生素B1含量明顯偏低。原因可能是某些嬰幼兒配方乳粉或面條，在調(diào)節(jié)pH后并未能使蛋白質(zhì)沉淀完全。可見，國標法和酸解法優(yōu)于等電點法。酸解法相較于國標法，省去了耗時最長的酶解步驟，仍獲得良好回收率。可見，酸解法前處理簡單，耗時短，結(jié)果準確度高，重現(xiàn)性好，適用于批量檢測，總體優(yōu)于國標法和等電點法。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果

表4 樣品分析結(jié)果

3 結(jié)論

分別采用國標法（GB 5009.84—2016）、酸解法和等電點法處理試樣，并調(diào)整流動相配比，采用高效液相色譜-熒光檢測法測定嬰幼兒配方食品中的維生素B1，為嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的測定提供理論基礎(chǔ)和具體方法。采用正丁醇作為提取劑，提取率較高。采用甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉（30∶70）作為流動相，可增加保留時間并改善峰形。且相較于離子對試劑，甲醇-0.05 mol/L乙酸鈉作為流動相對色譜柱的損害較小。3種方法的回收率和RSD（n=6）均符合要求。其中，國標法和酸解法的RSD值相對較小，等電點法的RSD值偏大。試樣經(jīng)國標法、酸解法處理測得維生素B1含量與標簽一致，少數(shù)試樣經(jīng)等電點法處理后測得維生素B1含量明顯偏低。酸解法相較于國標法，省去了耗時最長的酶解步驟，仍獲得良好回收率。可見，酸解法前處理簡單，耗時短，結(jié)果準確度高，重現(xiàn)性好，適用于批量檢測，總體優(yōu)于國標法和等電點法。

該方法可用于嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒谷類輔助食品中維生素B1的測定，從而為制定相關(guān)標準和監(jiān)管措施提供技術(shù)支撐。