從生物力學角度探討酒精對大鼠股骨干及股骨頭影響的實驗研究

申意偉 徐西林 張曉峰 李雪 呂航 張騁 白洋 李佐峰 范楨亮 趙軍

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.東北師范大學數學與統計學院，吉林 長春 130024

酒精消費已成為全球最嚴重的藥物濫用障礙之一。慢性長期酒精攝入對多種器官有害，包括大腦、心臟、肝臟、肌肉和骨骼[1-3]。雖然最近的研究表明，適量酒精攝入可能對骨性能和礦物質密度有益[4]，但短期過量或長期慢性酒精攝入可能與骨重建受損和骨折風險增加呈正相關[5]，甚至導致骨壞死發生[6-7]。骨骼生物力學作為評價骨結構力學和材料力學特性的重要方法[8-9]，從生物力學角度探討酒精對骨組織的影響，尤其是對股骨頭的影響，具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10周齡雄性 SD大鼠35只，清潔級，體質量(275±12)g，由遼寧沈陽長生科技有限公司提供，實驗動物質量合格證編號：SCXK(遼)2015-0001。屏障系統[實驗動物使用許可證：SYXK(黑)2016004]條件下，標準顆粒飼料喂養，周期照明，室內室溫 20～25 ℃，相對濕度 40%～70%，實驗期間動物自由飲食和飲水。

1.2 主要試劑和儀器

電子萬能材料試驗機(Instron 5569，英斯特朗-美國)，哈爾濱工業大學材料科學與工程實驗教學中心擁有；精密游標卡尺，精密度0.001 mm(上海首豐精密儀器有限公司)；精密切割機器(ZQ-50智能精密切割機，天津帝誠聯碩科技有限公司)；無水乙醇(上海振興化工一廠)，無菌蒸餾水稀釋制成體積分數為46%的酒精溶液。

1.3 分組及實驗方法:

適應性喂養1周，隨機分組，其中酒精組20只，46%(v/v)按10 g/(kg·d)灌胃，每周連續灌胃4天，停3天；空白組15只, 相同時間相同方式灌胃等體積生理鹽水，各組大鼠均自由攝水、攝食。

1.4 動物處死和骨組織標本獲取

4個月后各組大鼠均在腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉下處死，立即完整分離雙側股骨及右側脛骨近端。逆行剔除軟組織，游離肌肉肌腱，避免刀片等銳器劃傷骨表面(如有損傷則剔除)。在冰浴上，精密切割鋸沿股骨頭下緣完整切下雙股骨頭，并用砂紙將股骨頭斷面磨平。用生理鹽水浸透紗布包裹，放入液氮冷卻后轉至-80 ℃中保存，備做骨生物力學試驗。

1.5 股骨干三點彎曲實驗

室溫下，將股骨標本緩慢解凍，保持其濕度，放置在力學實驗機支架上(Instron 5569，英斯特朗-美國)，曲面向下，使股骨中點、兩支點中心與加載點重合，勻速加載至標本斷裂，描記出載荷-變形(撓度) 曲線(圖2)。測試溫度23 ℃，試驗機載荷測量精度0.001 N，位移(撓度) 測量精度0.001 mm，支座跨距20 mm，壓頭直徑為1.5 mm，加載速度1 mm/min，選用1 000 N以內的小載荷量程，用游標卡尺測量斷骨內徑和壁厚，精度0.001 mm，記錄并分析實驗數據。

1.6 股骨頭壓縮實驗

將股骨頭下斷面磨平，用游標卡尺測量股骨頭下緣到軟骨面最遠處記為股骨頭的高度，并測量股骨頭直徑。將濕潤的股骨頭標本置于電子萬能材料試驗機(Instron 5569)上，加載速度為1 mm/min記錄實驗數據，繪制載荷-變形曲線(圖2)，其他測試條件同股骨干三點彎曲實驗。壓縮試驗中為了減少邊界效應，在斷面涂潤滑劑。

1.7 右側脛骨近端 HE染色

骨組織標本放入4 %多聚甲醛(pH=7.4)中浸泡3 d達到充分固定, 然后用體積分數為10 %乙二胺四乙酸(EDTA，pH=7.4)，室溫下脫鈣28 d，脫水、石蠟包埋、切片(3 μm厚度)，光鏡下觀察分析。

1.8 統計學處理

2 結果

酒精組較空白組骨小梁數量減少，骨小梁厚度變窄、間隙增大，骨密度降低。見圖1。

圖1 右脛骨HE染色Fig.1 HE staining for the right tibia

圖2 載荷-形變曲線圖Fig.2 Load-deformation curve

圖2為股骨頭壓縮試驗和股骨干三點彎曲試驗所記錄的載荷-形變曲線圖，圖中A-B考慮股骨頭軟骨形變為主，受游離股骨頭斷面不平整導致應力集中影響較大。B-C考慮股骨頭軟骨下形變為主，曲線呈直線變化，屬彈性形變。C-D為塑性形變，載荷對股骨頭產生不可逆損傷。D-E為股骨頭被外力破壞，由于有機質和關節軟骨的存在，加之骨小梁間隙尚存，碎裂骨片間位移、相互作用導致應力集中-破壞交替現象。E-F為股骨頭被幾乎完全壓扁，骨小梁間隙幾乎完全消失，變化多呈直線趨勢。G為股骨干屈服點，代表骨抵抗形變的能力；H為最大載荷點，代表骨所能承受極限外力，表征骨抵抗破壞的能力；I為破壞載荷點，有時與H點重合，是對骨小梁強度、結構連續性、皮質厚度、橫截面積和材料質量的反映。

2.1 大鼠股骨干結構力學參數比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨干最大載荷、破壞載荷等結構力學參數均不同程度地減少，彈性撓度和最大撓度不同程度地增加，差異均有統計學意義 (P<0.05)，股骨干彈性載荷、破壞撓度及彎曲能量未見顯著變化(P>0.05)，見表1。

表1 股骨干三點彎曲試驗測試大鼠股骨干結構力學參數Table 1 Three-point bending test to test the structure mechanical parameters of the femoral shaft in

注：與酒精組比較，*P<0.05。

2.2 大鼠股骨干材料力學參數比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨干彈性模量、剛度系數材料力學參數均不同程度地減少，差異均有統計學意義 (P<0.05)；股骨干韌性系數、彈性應變和最大應變均不同程度升高，差異均有統計學意義 (P<0.05)；其中，彈性應力和最大應力未見顯著變化(P>0.05)，見表2。

表2 三點彎曲試驗測試大鼠股骨干材料力學參數Table 2 Three-point bending test to test the material mechanical parameters of the femoral shaft in

注：與酒精組比較，*P<0.05。

2.3 大鼠股骨頭壓縮試驗參數比較

與空白組相比，酒精灌胃組大鼠股骨頭彈性載荷和最大載荷均不同程度地降低，差異均有統計學意義 (P<0.05)；股骨頭能量吸收及最大形變率彈性應力和最大應力未見顯著變化(P>0.05)，見表3。

表3 股骨頭壓縮試驗力學參數Table 3 Mechanical parameters of compression test for the femoral

注：最大形變率=最大載荷時股骨頭被壓形變/股骨頭高度×100%。

2.4 酒精組股骨頭最大載荷與股骨干彈性模量相關性分析

股骨干彈性模量是股骨重要生物力學參數，與骨的幾何形狀無關，反映骨內在剛度[11]。為分析股骨頭最大載荷與股骨干彈性模量相關性，行Pearson 相關性檢驗，t=2.6108，P=0.013，說明二者有相關性。由圖2可知，股骨頭最大載荷(Fmax)隨著股骨干彈性模量(modulus，M)增大而呈現增大趨勢。進一步，行線性回歸分析得，Fmax=16.261×M+26.509。

圖3 股骨頭最大載荷(Fmax)與股骨干彈性模量(M)的散點圖注：圖中藍色直線為線性擬合直線，灰色區域為擬合殘差區域。Fig.3 Scatter plot of maximum femoral head load (Fmax) and femoral shaft elastic modulus (M)

3 討論

關于酒精攝入對骨代謝的影響的組織學研究結果存在爭議[12]，有證據表明劑量依賴性影響骨形成和再吸收的不平衡[13]。總體而言，酒精誘導的骨重建調節的病因是多因素的，可能涉及對骨代謝直接和間接作用[14]。酒精誘導的骨量丟失的間接作用繼發于雌二醇(E2)水平的目標變化，PTH-維生素D軸的調節，生長刺激的肝胰島素(GH)樣生長因子1型(IGF-1)和氧化應激的影響。骨骼的結構會隨著酒精攝入而發生變化，尤其是長期酗酒者，骨結構改變，力學性能隨之而變。本研究中，長期大量灌胃酒精造成大鼠股骨生物學變化，股骨干的最大載荷、破壞載荷等結構力學參數均不同程度地減少，股骨干彈性模量、剛度系數材料力學參數均不同程度地減少，表明慢性酒精暴露對骨礦質形成有抑制作用，股骨干抵抗破壞性能減弱，骨脆性增加而易斷，這種抑制作用可從股骨干生物力學變化可見一斑。脛骨近端病理染色亦驗證了長期酒精攝入對骨代謝的影響(圖1)，體現了骨形態和功能的相關性[15]。股骨干韌性系數、彈性應變和最大應變均不同程度升高，彈性撓度和最大撓度不同程度地增加，提示股骨干有機質相對增多，該變化考慮無機質丟失過多所致。

可簡單地將骨骼分為密質骨和松質骨[16]，骨骼是由多種材料(有機質、無機質)構成的復合體，呈非均勻分布的特點。股骨的形狀較其他骨的形狀更加接進空心圓筒,其應力分析可用空心圓筒近似，而其他骨的形狀較復雜，分析的結果誤差較大。最大荷載直接反映松質骨的骨小梁的骨質、結構的連續性、皮質骨的強度、骨的橫截面積的大小等，是對骨質量的綜合反映，可直接從荷載-變形曲線(圖2)上讀取，本研究中股骨干和股骨頭最大荷載均降低，提示酒精導致骨耐外力性能降低。結構力學參數主要反映出骨的結構特征的變化，它主要受到骨重建過程中骨的幾何形狀、體積、密度分布的變化的影響，當然，骨的強度、彈性模量等材料力學指標的變化對它也有一定影響。骨的成分與生物力學指標之間的關系變化是復雜的，需采用多方面的因素來衡量，總體而言，骨礦含量的變化對彈性區的影響較大，而有機質的變化對塑性區的變化影響較大。酒精抑制骨形成[17]，增加破骨細胞活性，使骨礦量減少，有機質相對增加，表現出股骨干彈性模量和剛度降低，股骨干韌性系數、彈性應變和最大應變均不同程度升高，關于酒精引起股骨干生物力學變化的詳細分子及細胞機制需進一步研究。本研究采用游離股骨頭進行壓縮測試，消除了股骨頸和股骨干形變的影響。分析了酒精導致股骨頭生物力學的變化，由于股骨頭并非密度均勻、形態規則、組織單一的球體，除了堅硬的骨組織，表面覆蓋較軟的關節軟骨，因此游離股骨頭壓縮實驗表現出載荷先隨形變緩慢上升，至軟骨完全壓平后，由于軟骨下骨組織彈性形變表現出直線上升，變形至屈服點后，發生塑性形變，隨后出現最大載荷，終止股骨頭完全破壞。結果表明酒精可引起大鼠股骨頭最大載荷減低，減弱股骨頭抵抗外力性能，提示酒精導致股骨頭壞死的風險。進一步分析表明，骨頭最大載荷與股骨干彈性模量具有相關性，提示可從股骨干生物力學性能來粗略地評估酒精對股骨頭的影響，為股骨頭壞死的防治及療效評估提供一種參考[18]。

本研究測試結果表明，長期酒精攝入導致大鼠股骨干剛性降低，骨頭最大載荷與股骨干彈性模量具有相關性，提示可從股骨干生物力學性能來粗略地評估酒精對股骨頭的影響；長期酒精攝入導致大鼠股骨干韌性相對增高，股骨干和股骨頭抵抗外力性能降低，易發脆斷，推測酒精導致骨組織礦質和有機質成分變化，提示長期酒精攝入對骨組織的不良反應。