補腎藥膳方影響卵巢去勢骨質疏松模型大鼠骨形成機制探討

張潔 林靜 陳燕*

1.湖南中醫藥大學護理學院，湖南 長沙 410208 2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)其特征是骨量減少，骨組織結構破壞。隨著社會老齡化進程的加速，以老年人和絕經后婦女多見的骨質疏松癥患病人群逐漸增加，資料[1]顯示，我國骨質疏松患病率在50歲以上女性人群中約為40.1%，超過20%的女性在圍絕經期即會出現骨量減少。骨質疏松所導致的骨折明顯加重了家庭與社會負擔，增加中老年的病殘率及病死率[2]。骨質疏松發生后難以逆轉，加強預防則能更有效地降低骨折的發生率。隨著中醫理論的發展，有學者根據“腎主骨”理論進行實驗研究，認為導致PMOP癥的重要原因是天癸竭、腎氣衰、髓化生無源[3]。基于中醫藥食同源理論，中醫藥膳成為防控老年人常見病的應用熱點，其中包括PMOP。已有研究表明，用羊肉、狗肉、羊腎、豬骨等食材輔以中藥可有效預防老年骨質疏松癥[4]。2013年《國務院關于促進健康服務業發展的若干意見》文件指出，要“加強藥食同用中藥材的種植及產品研發與應用，推廣科學規范的中醫保健知識及產品”。2016年中華中醫藥學會發布《健康管理服務規范》、《藥食同源藥膳標準通則》兩項團體標準，為藥膳食療有效與安全應用提供依據。開展藥膳防控PMOP研究，為中醫食療養生與飲食預防疾病提供理論支持，為進一步開發藥膳產品提供研究基礎，對促進老年健康產業的發展具有重要作用。本文基于“腎主骨”、“藥食同源”等理論，結合前期課題組研究的自擬補腎藥膳方對常見骨形成代謝代表性指標骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)、I型原膠原N-端前肽(propeptide of type I Procollagen, PINP)等的影響，補充常見代謝代表性指標骨鈣素(bone gla protein, BGP)水平的變化，綜合分析自擬補腎藥膳方影響卵巢去勢骨質疏松模型大鼠骨形成機制，旨在為探索補腎藥膳方對PMOP模型大鼠骨形成的作用機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：60只SPF級雌性SD大鼠，初始體重200～220 g，喂養環境溫度為(25±1)℃，濕度70%，進食大鼠標準飼料和凈化水。入選標準：SPF級4～5月齡雌性大鼠；未曾交配；體重200 g～220 g。排除標準：適應性飼養一周后體重>300 g或<200 g大鼠；出現毛發粗糙、無光澤等不健康表現。脫落標準：實驗過程中各種原因導致的大鼠死亡。

1.1.2實驗藥物：采用文獻法及德爾菲專家咨詢法對防治PMOP的補腎藥膳方進行篩選[1]，確定補腎藥膳方由狗肉200 g(君藥)，羊腎150 g(臣藥)，山藥30 g(佐使藥)，枸杞30 g(佐使藥)組成。上述食材清洗后加水2 000 mL武火煮沸后文火煲煮1 h，取湯汁。分高劑量(第一次湯汁)和低劑量(2 000 mL水稀釋第一次湯汁)，冷藏備用。

1.2 實驗方法

1.2.1動物造模及分組；對60只大鼠進行編號，稱重后隨即分出正常組、假手術組。將剩余40只大鼠去卵巢，以建立絕經后骨質疏松大鼠模型，再根據隨機數字表進行分組。共6組，每組10只，分別為正常組、假手術組、模型空白組、高劑量藥膳組(簡稱高劑量組)、低劑量藥膳組(簡稱低劑量組)、骨疏康顆粒組(簡稱骨疏康組)。

1.2.2動物給藥方法及標本采集：正常組、假手術組以及模型空白組大鼠選用一般飼料飼養，高劑量組、低劑量組與骨疏康組大鼠分別采用高劑量藥膳、低劑量藥膳、骨疏康進行灌胃，劑量根據人體給藥劑量的6.0倍計算。連續給藥12周，從腹主動脈取血低溫分離血清，存于-80 ℃冰箱。

1.3 指標監測

實驗采用Elisa法檢測血清，按Elisa試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供，E-EL-R0113c)說明書進行檢測血清BGP、BALP水平。

1.4 統計學處理

2 結果

通過單因素方差分析，6組大鼠的血清BGP水平差異有統計學意義。模型空白組、高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清BGP水平顯著高于正常組(P<0.01)，認為卵巢去勢骨質疏松大鼠造模成功。假手術組血清BGP水平與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)，認為PMOP癥造模成功可排除手術的影響。模型空白組、高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清BGP水平均顯著高于假手術組(P<0.05)，差異具有統計學意義，認為摘除卵巢是影響骨質疏松大鼠骨代謝指標變化的因素。低劑量組與高劑量組與模空組之間差異無統計學意義，但血清BGP具有下降的趨勢，骨疏康組血清BGP水平高于模空組(P<0.05)，見表1。

項目BGPF值P值正常組(n=10)87.69±5.87假手術組(n=10)85.40±5.00a模空組(n=8)108.85±1.61b55.946<0.001高劑量組(n=9)105.41±3.14b低劑量組(n=10)105.47±2.69b骨疏康組(n=10)103.69±4.70b, c

注：與正常組比較，aP>0.05；與假手術組比較，bP<0.05；與模空組比較，cP<0.05。

3 討論

3.1 補腎藥膳與絕經后骨質疏松

中醫理論認為PMOP癥歸屬于“骨痿”、“骨痹”，《醫經精義·中卷》云：“腎藏精，精生髓，髓養骨”，PMOP癥多見腎虛型，腎精漸衰、骨髓生化無源、骨髓空虛，則可導致骨質疏松癥的發生。老年人骨質偏脆，容易發生骨折等一系列臨床癥狀，以腎虛為其內因，提示腎與骨質疏松癥有著極其密切的關系。此外，瘀血阻滯、脾胃虛弱、肝血不足也是PMOP癥發生的重要方面[5-7]。PMOP癥屬于高轉換型骨質疏松癥，骨形成與骨吸收均活躍，兩者之間發生失衡。目前，大量臨床試驗證實基于補腎理念的中醫藥在防治PMOP癥上取得了顯著療效[8-10]。WHO曾于1989年提出，飲食調節為防控PMOP癥的三大原則之一。中醫藥食同源、同功、同理等理論認為食物同藥物一樣具有寒熱溫涼、辛甘酸苦咸、升降浮沉等作用，適用于預防和補益[11-12]。對于已發生的PMOP癥，中藥為補腎療法，其中補腎藥膳對防治PMOP癥也逐漸有所報道，壯陽狗肉湯、枸杞羊腎粥等藥膳在改善腰膝酸軟、益精補氣等方面具有顯著療效[13-14]。

3.2 補腎藥膳方對絕經后骨質疏松骨形成代謝指標的影響

3.3.1前期研究基礎

本研究自擬的補腎藥膳相互補充，溫腎壯陽、補中益氣、益腎澀精、補脾養胃、養肝滋腎。前期研究中可知補腎藥膳方能有效改善PMOP癥模型大鼠的CTX-Ι的水平以及骨組織形態[15-16]。據課題組前期研究[17-18]表明，在骨代謝形成指標BALP、PINP等方面，補腎藥膳方亦能發揮相應作用。單因素方差分析顯示，在BALP水平方面，血清BALP水平在模型組與假手術組間(P<0.01)，模型組與低劑量組及骨疏康組間(P<0.05)，高劑量組與低劑量組及骨疏康組間差異存在統計學意義(P<0.05)。在PINP血清表達方面，低劑量組、高劑量組、骨疏康組3組均顯著較模型空白組高。

3.3.2補腎藥膳方對BGP、BALP、PINP等骨形成代謝性指標影響

絕經后婦女卵巢功能減退，雌激素水平下降，致使成骨細胞凋亡加速，使骨吸收增多，骨轉換率升高[19]。骨形成標志物可反映骨轉換的狀態，可用于骨質疏松治療療效評價中，其中BGP、BALP、PINP等是骨代謝形成代表性指標[20]。

BGP由成骨細胞合成，分泌入血，是反映骨形成速率的特異性指標。其主要作用是維持骨的正常礦化，抑制軟骨的礦化速率，在高轉換率的代謝性骨病中起重要作用，與血清BALP水平呈正相關[21]。本研究中，通過對卵巢去勢絕經后骨質疏松模型大鼠進行干預，模型空白組血清BGP水平最高，與正常組間差異存在統計學意義，說明絕經后婦女亦存在成骨增強。骨疏康顆粒組與模型空白組之間的血清BGP水平差異存在統計學意義，高劑量組、低劑量組血清BGP有下降趨勢。

BALP在新骨形成、礦化作用中起一定作用，反映成骨細胞活動。在絕經后骨質疏松癥婦女中，研究[22]發現，血清BALP水平處于高水平狀態并隨著絕經年齡的增加而增加，骨吸收大于骨形成，腎與骨中的ALP流失入血，血液中BALP水平增多[23]，主要原因是由于骨的代謝加速，低劑量藥膳與骨疏康均能有效下降高轉換狀態下的BALP水平，對于抑制絕經后高轉換水平具有一定作用。

PINP反映了新合成的I型膠原蛋白的變化[24]，骨形成活躍時，其在血清中的水平升高，成骨增加。由狗肉、羊腎、枸杞、山藥組成的補腎藥膳方可有效增高卵巢去勢骨質疏松模型大鼠的PINP水平，在促進成骨增加方面發揮了重要作用[17]。

3.3.3補腎藥膳方對骨形成代謝性指標影響差異的分析

研究綜合發現補腎藥膳方中的高劑量藥膳、低劑量藥膳均可改善PMOP癥大鼠的血清PINP水平。對BALP的干預作用低劑量組較模型空白組差異存在統計學意義。但在血清BGP方面的干預作用較BALP、PINP弱，僅有下降趨勢，差異無統計學意義。認為補腎藥膳方在影響骨形成方面作用如骨形成速率、新骨形成或礦化、增加成骨量等方面值得進一步深入探討，以闡述藥膳防治PMOP癥的機理。

隨著骨質疏松機理研究的深入，中醫藥防治PMOP癥的相關研究在骨代謝水平、骨密度、信號通路等方面均有較大的發展。本研究主要探討了補腎藥膳對骨形成代謝指標的影響，在骨吸收方面及機制方面的研究缺乏相應的指標說明。此外，本研究發現低劑量藥膳、高劑量藥膳對改善骨代指標方面存在差異，其影響因素值得進一步探討，對于藥膳劑量的精準確定可作為今后的研究方向。

4 小結

在我國人口老齡化面臨嚴峻的挑戰，健康中國戰略的實施，大健康觀念的樹立等背景下，加強中醫治未病及健康維護已成共識。中醫理論認為PMOP癥的病因病機有腎精虧虛、瘀血阻滯、脾胃虛弱、肝血不足等方面。其中腎精虧虛與骨質疏松癥的發生發展密切相關，是本病根本病機，補腎法是中醫治療PMOP的基本大法。以中醫治未病作為理論指導，基于“腎主骨”、“藥食同源”等中醫理論下的補腎藥膳能影響去勢大鼠的骨形成代謝指標，低劑量藥膳效果優于高劑量，接近相當于骨疏康的效果，補充發展了相關中醫理論。本研究探討了補腎藥膳在骨形成方面的作用，對PMOP機制的深入研究以及補腎藥膳方防治PMOP癥的積極作用具有重要的推廣價值和學術意義。