滋陰補腎方對糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠的作用及對Wnt/β-catenin信號的影響

孫勤國 徐鴻婕 羅蒙 江波* 呂琨 楊倩 黃天慧 張賢梅

1．武漢大學同仁醫院(武漢市第三醫院)中醫科，湖北 武漢 430060 2．湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430060

糖尿病合并骨質疏松(osteoporosis, OP)是一種全身性代謝性骨病，主要特征為骨量系統性減少、骨組織結構退化，是一種代謝障礙性疾病[1-3]。糖尿病合并骨質疏松可導致骨強度降低、骨密度降低、骨脆性增加，發生骨折的風險增加，是目前世界上發病率較高，醫療支出負擔較重的慢性疾病之一。進入更年期的婦女，由于卵泡數量明顯減少，卵巢功能低下，從而雌激素(E2)缺失和衰老的疊加作用，使得OP在絕經后婦女人群中的發病率相對較高[4-5]。骨是E2發揮作用的主要靶器官之一，E2缺乏導致骨代謝中破骨細胞和成骨細胞的之間的相互制衡關系被打破，破骨細胞數量增加，骨吸收與骨重建的失衡，最終導致骨量丟失[6-9]。因此，對于糖尿病合并骨質疏松的治療和研究迫在眉睫。

Wnt/β-catenin信號通路是調控成骨分化的一條重要通路，β-catenin調控細胞增殖、定向分化過程[10]。李俊峰等[11]研究認為Wnt/β-catenin信號通路在調節調控骨量上發揮重要作用。滋陰補腎方由生龍骨、生牡蠣、桑寄生、續斷、淫羊藿、天花粉、黃連組成。生龍骨和生牡蠣常相須為用，以治陽亢、益陰。董佳梓等[12]通過研究具有滋補腎陰作用桑寄生、枸杞子和桑椹對去卵巢所致大鼠骨質疏松癥的治療作用及其機理，桑寄生的作用是促進OPG蛋白表達，降低IL-1含量；商學征等[13]觀察補腎通絡中藥(淫羊藿、黃芪、鹿角膠、生地黃、補骨脂、女貞子、三七、丹參、地龍)可明顯改善糖尿病骨質疏松患者超聲骨密度，調節平衡能力。本研究以糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠為對象，探索滋陰補腎方對其作用及其相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

50只SPF級雌性SD大鼠，3月齡，體質量(250±14)g，購于湖北省疾病預防控制中心。飼養環境室溫控制在23 ℃左右，濕度60%左右，自然光源，標準飼養，自由飲水一周，適應環境。將大鼠分為正常對照組、模型組、骨化三醇組、滋陰補腎方低劑量組、滋陰補腎方中劑量組、滋陰補腎方高劑量組。大鼠的模型建立方法：腹腔內注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉成功后，固定大鼠向上，常規消毒，無菌條件下于大鼠最末肋骨下，腋中線至脊柱外側約1 cm處備皮，切開皮膚、肌肉和腹膜，輕輕拉出脂肪團暴露卵巢，結扎卵巢下端輸卵管，摘除雙側卵巢，止血后，逐層縫合，關腹。縫合切口，外敷消炎粉。術后正常飼養，切口每日消毒。進食高糖高脂飼料。喂養14 d之后，禁食12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，30 mg/kg，一次性注射。造模成功后，灌胃給藥8周，每日一次。骨化三醇組灌胃骨化三醇0.1 μg/(kg.d)。滋陰補腎方由生龍骨30 g、生牡蠣30 g、桑寄生10 g、續斷10 g、淫羊藿10 g、天花粉10 g、黃連10 g組成；以上藥物均購于同仁醫院中藥房，經過中藥傳統方法浸潤、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑，按人與大鼠給藥換算比計算相當生藥量5、10、20 g/(kg.d)制成低、中、高劑量。

傳統水輪發電機組振動在線監測與故障診斷系統基本都是采用單機式集中控制系統，利用變送器和傳感器將所有監測機組的狀態參量、電量以及非電量信號收集到計算機中，并按照相關規定進行計算、判斷和維修。由于該集中控制系統具有較多的缺陷，如果中央控制計算機一旦出現故障，那么整個生產過程就會癱瘓。

p-NF-kB兔抗，購于Abcam，貨號：ab28856；NF-kB兔抗，購于Abcam，貨號：ab16502，IkB兔抗，購于Abcam，貨號：ab7217；MyD88兔抗，購于Abcam，貨號：ab131071；GAPDH兔抗，購于Cell Signaling Technology，貨號：2118；Goat Anti-Rabbit IgG羊抗，購于Bioswamp，貨號：PAB160011。

骨組織以液氮冷凍后鋼錘砸碎，加入超聲裂解細胞，超聲裂解。4 ℃下15 000 r/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據BCA蛋白定量結果上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉膜后NC膜TBS稍蕩洗，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育p-NF-kB(稀釋比為1∶1 000)，NF-kB(稀釋比為1∶2 000)，IkB(稀釋比為1∶2 000)，MyD88(稀釋比為1∶2 000)一抗過夜，TBST洗10 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復3次，曝光顯影；采用 BIO-RAD Image Lab 軟件進行灰度值分析。

1.2 HE染色

用Trizol法提取組織總RNA后反轉錄得到cDNA。PCR擴增條件為95 ℃變性5 min后；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，72 ℃延伸5 min。目標基因的表達量用2-ΔΔCt法計算。PCR引物經Primer 6.0軟件設計，如下表1。

1.3 Western blot

2.5 m時的過流能力分別為0.442 m3/s、1.070 m3/s。 按式(1)計算得出魚道池室的容積功率耗散約為19.92 W/m3、19.29 W/m3，紊動不劇烈，適合魚類上溯。

1.4 ELISA檢測血清中相關指標的變化

AS屬于中醫學“脈痹”范疇，為正氣虧虛，五臟功能失調，痰瘀互結阻于脈道所致，熱毒內蘊是易損斑塊病機演變的重要環節。臨床治療當隨證治之，扶正補虛法、活血化瘀法和清熱解毒法常聯合使用，通過調節血脂、抗氧化、保護內皮功能、抗血小板聚集黏附、抗血栓及抗血管平滑肌增殖等機制，以發揮中醫藥多環節、多途徑、多靶點治療AS的優勢，全面干預AS的發生和發展。

1.5 RT-PCR

給藥周期結束后，斷頭處死大鼠，脫鈣后的脛骨經過脫水，包埋于蠟塊中，以5 μm的厚度均勻切片。將蘇木精加入蒸餾水內加溫溶解，冷卻后加入乙醇和甘油，備用。石蠟切片脫蠟至水。用Regaud蘇木精染液染核7 min。置于容器中，流水沖洗2 h。以1%的鹽酸乙醇溶液分化3 s，用伊紅染液染色5～10 min。用95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察各組大鼠脛骨骨小梁病理變化。

和正常對照組比較，模型組的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表達水平均升高；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88表達水平均降低。

表1 引物列表Table 1 Primer sequences

1.6 統計學處理

同時，寧夏圖書館設立少兒圖書分館，為青少年讀者提供了良好的閱讀環境，增加的各種圖書和繪本也吸引了更多青少年讀者。親子閱讀也將成為今后重點活動之一。

2 結果

2.1 滋陰補腎方對脛骨形態的影響

和正常對照組比較，模型組大鼠的骨小梁排列紊亂疏松干癟，小梁寬、間距變大，骨小梁之間連接變少。滋陰補腎方低劑量組脛骨排列較紊亂疏松干癟，小梁間距較大，連接較少。滋陰補腎方中劑量組脛骨排列較疏松，整齊，小梁寬、間距變小，之間連接漸變多；滋陰補腎方高劑量組脛骨骨小梁排列較密集，骨小梁之間連接增多。

以ELISA的方法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平。根據試劑盒的說明書稀釋標準品。繪制標準曲線。在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度的標準品50 μL。分別設空白孔(空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗體，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗體10 μL。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。

圖1 滋陰補腎方對脛骨形態的影響(×100)Fig.1 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the morphology of the tibia (×100)

2.2 滋陰補腎方對炎癥相關通路的影響

觀察組治療總有效率96.88%（顯效18例+有效13例）；對照組治療總有效率78.13%（顯效13例+有效12例）。兩組數據比較，觀察組治療總有效率高于對照組，差異有統計學意義（x2=5.14，P＜0.05）。

圖2 與炎癥相關蛋白和基因的表達注：圖2 A為p-NF-kB、NF-kB、IkB、MyD88蛋白的表達；圖2B、圖2C、圖2D分別為Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表達水平；與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.2 Expression of inflammation-related proteins and genes

檢測Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的mRNA表達水平見圖2。和正常對照組比較，模型組的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表達水平均顯著降低(P<0.05)；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的Wnt-3α、LRP-5、β-catenin表達水平均顯著升高(P<0.05)。

2.3 滋陰補腎方對血清中相關指標

和正常對照組比較，模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均顯著升高(P<0.05)；和模型組比較，骨化三醇組，中劑量組和高劑量組的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10的水平均顯著降低(P<0.05)。

表2 滋陰補腎方對血清中相關指標的影響Table 2 Effect of nourishing Yin and tonifying kidney recipe on the related indicators in serum

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

糖尿病合并骨質疏松是一種全身性代謝性骨病，其主要是由于患者體內代謝平衡被打破、骨密度降低等特點導致骨組織微結構被破壞，骨脆性增加，從而使患者骨折風險大大增加，給患者帶來不便和困苦[14]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路對骨代謝的影響日益受到關注。β-鏈蛋白(β-catenin)在Wnt信號通路中起到關鍵性作用[15-16]。C3H10T1/2細胞是可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞的多潛能干細胞系，在BMP-2的作用下可以分化為成骨細胞[17]。Bain等[18]發現，BMP-2可以促進C3H10T1/2細胞分化為成骨細胞，在此過程中，在BMP-2的調控下，C3H10T1/2細胞過渡表達β-catenin，使成骨細胞分化的早期標志物ALP表達活躍。此外，Wnt參與成骨細胞分化形成的過程。穩定表達Wnt1/Wnt3α能促進C3H10T1/2細胞系的增殖，并激活標志物ALP的活性[19]。Wnts不僅促進了成骨細胞的生長，還能促進成骨細胞早期分化的過程。LRP-5表達于成骨細胞的表面，對骨量的積累過程中起到重要的作用，LRP-5的功能喪失性突變可導致骨量減少，骨質疏松；功能獲得性突變能夠導致高骨密度癥。它還是Wnt蛋白的跨膜蛋白，通過Wnt/LRP-5信號通路調節成骨細胞的增殖和分化，從而影響人體骨量的積累[20]。有研究證明，LRP-5的表達改變或者功能丟失，可阻止骨質的獲得，致使體外培養鼠的頭蓋骨質密度降低，骨質厚度變薄[21-22]。本文研究了糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠在滋陰補腎方的作用下，Wnt/β-catenin和Wnt/LRP-5信號通路的表達情況。結果顯示，糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠經過滋陰補腎方的干預作用后，Wnt-3α、LRP-5、β-catenin的表達均升高，提示滋陰補腎方可通過激活Wnt/LRP-5和Wnt/β-catenin信號通路，可能增加成骨細胞的數量，增加骨量。這和滋陰補腎方高劑量組脛骨骨小梁排列較密集，骨小梁之間連接增多的結果相符。

研究發現，糖尿病腎病是一種炎癥疾病。在糖尿病合并骨質疏松的發展過程中，腎小球和腎小管的炎癥反應為其主要的病癥之一。炎性細胞大量浸潤及細胞因子、趨化因子等炎癥反應因子的產生在糖尿病的損害中發揮重要作用[23]。其中TLR-MyD88信號通路在炎癥信號的傳導中起著至關重要的作用。MyD88參與了糖尿病炎癥反應和發展的全過程，它調控的下游因子NF-κB可激活多種炎癥因子(IL-6，IL-10等)的表達來發揮作用，此外，可調節TGF-β1的表達致使腎臟的纖維化。因此，TLR-MyD88信號通路是糖尿病炎癥反應中，導致NF-κB活化的關鍵性通路[24-25]。糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠經過滋陰補腎方的干預作用后，p-NF-κB、NF-κB、IkB以及MyD88蛋白表達水平均顯著降低，提示滋陰補腎方抑制了MyD88和NF-κB的表達，可能有效抑制了其相關的炎癥通路。同時，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8，IL-10等炎癥因子的水平隨著滋陰補腎方的劑量而逐漸降低，提示滋陰補腎方對機體的糖尿病癥有所緩解，可達到增加骨密度的目的。

綜上，滋陰補腎方治療糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠可顯著增加其成骨細胞的數量，增加骨量，可能是通過抑制NF-κB炎癥通路，并激活Wnt/β-catenin信號通路對其產生影響。