上調(diào)NDRG1表達(dá)降低奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率

崔 喆，商 震，谷 樂，徐 蘭

0 引言

結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)病率在我國有逐年上升趨勢，年輕患者增多[1]，隨著奧沙利鉑(Oxaliplatin，OHP)在化療中的引入，結(jié)直腸癌的生存期得到延長[2]，其靶向藥的研發(fā)及臨床應(yīng)用，進(jìn)一步提高了晚期結(jié)直腸癌患者的無病生存期及總生存期[3]。靶向藥物與化療聯(lián)合應(yīng)用，包括免疫治療的引入，可能延長晚期結(jié)直腸癌的生存期[4]。NDRG1(N-myc downstream regulated gene1)為人N-myc下游調(diào)節(jié)基因，在結(jié)直腸惡性腫瘤中為抑癌基因，對細(xì)胞的分化、增殖及凋亡等功能具有重要的調(diào)控作用[5]。奧沙利鉑耐藥是導(dǎo)致患者治療終止的主要原因之一，針對靶基因進(jìn)行調(diào)控，可能改善結(jié)直腸腫瘤奧沙利鉑耐藥。本研究對結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑毒性反應(yīng)及奧沙利鉑耐藥細(xì)胞在上調(diào)NDRG1表達(dá)后的反應(yīng)進(jìn)行了檢測，并初步探討了其可能機(jī)制，目的在于探索改善結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥的靶基因，作為進(jìn)一步實驗研究的基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料 細(xì)胞株(SW480、SW620、HCT116)購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)采用L-15細(xì)胞培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，中國醫(yī)科大學(xué)中心實驗室)，以持續(xù)的自低向高的濃度梯度給予奧沙利鉑于細(xì)胞培養(yǎng)液中，建立奧沙利鉑耐藥的穩(wěn)定HCT 116細(xì)胞株(OHP-HCT 116),繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行傳代。耐藥細(xì)胞株建立時奧沙利鉑以4 μmol/L為起始濃度，對存活及融合達(dá)到75%的細(xì)胞株進(jìn)行傳代，經(jīng)過3代后進(jìn)行奧沙利鉑濃度的提高，濃度提高順序為4、8、12、15、20 μmol/L，繼續(xù)傳代5代，即為奧沙利鉑耐藥的OHP-HCT 116組，HCT 116組為非耐藥組，MOCK為空白對照組，siNC為陰性轉(zhuǎn)染對照組。上調(diào)NDRG1表達(dá)的商業(yè)化質(zhì)粒(pEGFP-NDRG1-N3)由大連寶生生物科技有限公司設(shè)計合成。研究中所用NDRG1多克隆抗體、p53單克隆抗體及Bcl-2單克隆抗體由北京中杉金橋公司提供。qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Santa-Cruz，MTT試劑盒及流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。引物設(shè)計及合成由南京浩博生物技術(shù)有限公司提供，以下所有試驗均重復(fù)3次。

1.2 研究方法

1.2.1 MTT(Methyl-thiazolyl-tetrazolium)法 MTT法進(jìn)行奧沙利鉑干預(yù)后細(xì)胞存活率測定，判斷化療毒性。取對數(shù)生長期細(xì)胞(SW480、SW620、HCT116、OHP-HCT 116)，對細(xì)胞懸液進(jìn)行濃度調(diào)整，37 ℃及5%CO2條件下進(jìn)行孵育，在96孔板進(jìn)行細(xì)胞接種(密度：5×104/ml，復(fù)孔：5個)，培養(yǎng)基中進(jìn)行72 h的培養(yǎng)，加MTT液(20 μl/孔)，37 ℃條件下進(jìn)行4 h的孵育，去除上清液，加150 μl二甲基亞砜，在搖床上進(jìn)行震蕩約10 min，上酶聯(lián)免疫儀，在OD490 nm進(jìn)行光密度值的測量，實驗進(jìn)行3次重復(fù)后分析。

1.2.2 qRT-PCR法(Quantitative real time polymerase chain reaction，即時定量聚合酶鏈鎖反應(yīng))

首先進(jìn)行抽提樣品RNA：冰凍細(xì)胞進(jìn)行裂解及溶解后，按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行兩相分離沉淀RNA，依次進(jìn)行清洗及干燥RNA，將RNA沉淀溶解。然后以紫外吸收法及變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA質(zhì)量(包括濃度及純度測定)；進(jìn)行樣品cDNA的合成，反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄buffer 2 μl、DEPC水 5 μl、dNTP 0.1 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5 μl、RNA模版2 μl、上游引物 0.2 μl、下游引物 0.2 μl，總體積為10 μl。進(jìn)行RT-PCR步驟，包括制備管家基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)梯度，將檢測樣品及陽性標(biāo)準(zhǔn)品上RT-PCR儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA模板的制定。對目標(biāo)基因進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系如下：SYBR Green 1染料10 μl、上游引物F 1 μl、下游引物R 1 μl、dNTP 1 μl、Taq聚合酶2 μl、待測樣品cDNA 5 μl、ddH2O 30 μl,總體積50 μl。上RT-PCR儀，反應(yīng)條件如下：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、55 ℃ 2 min，共40個循環(huán)，共40個循環(huán)，73 ℃條件下延伸7 min后進(jìn)行溶解曲線的分析。

1.2.3 Western blot免疫印跡法 按試劑盒操作要求對已經(jīng)用裂解液裂解的細(xì)胞進(jìn)行蛋白的抽提，將蛋白樣品收集后測定濃度，蛋白給予上樣，以100 min電壓100 V的條件進(jìn)行電泳，用PVDF膜進(jìn)行冰浴后轉(zhuǎn)到膜上，給予漂洗蛋白膜后進(jìn)行封膜，室溫條件下進(jìn)行60 min的封閉，將封閉液除盡，加入稀釋完成的Ⅰ抗，搖床上以溫度4 ℃給予1 h孵育后進(jìn)行Ⅰ抗回收，給予洗滌，加入Ⅱ抗。搖床上以溫度4 ℃給予1 h孵育后進(jìn)行Ⅱ抗回收，10 min洗滌后ECL進(jìn)行蛋白檢測及發(fā)光，對灰度值給予分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 長期的細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液并接種于24孔板，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。選擇融合度高于75%細(xì)胞，依照試劑盒要求步驟，以pEGFP-NDRG1-N3或陰性對照組(siNegaive control，siNC)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)進(jìn)行48 h培養(yǎng)，與空白對照組(MOCK組)及siNC組進(jìn)行對比，以qRT-PCR及Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡 按凋亡檢測試劑盒要求的操作步驟，取各組對數(shù)期生長細(xì)胞，按說明書步驟進(jìn)行操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測，并以Cell Quest軟件進(jìn)行結(jié)果分析，實驗重復(fù)3次，對凋亡率取平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑對不同人結(jié)腸癌細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥HCT 116細(xì)胞的毒性作用 分別以不同濃度梯度(0、10、20、40、80)μmol/L的奧沙利鉑對SW480、SW620、HCT 116及OHP-HCT 116細(xì)胞的毒性作用進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示，HCT 116細(xì)胞對奧沙利鉑最敏感，OHP-HCT 116細(xì)胞表現(xiàn)出對奧沙利鉑的耐藥性，見圖1。

圖1 奧沙利鉑對不同人結(jié)腸癌細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥HCT116細(xì)胞的毒性作用

2.2 qRT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率 以脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-NDRG1-N3分別轉(zhuǎn)染HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞，以qRT-PCR和Western blot分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后效率檢測，在HCT116細(xì)胞，與MOCK組及siNC組比較，pEGFP-NDRG1-N3組NDRG1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，轉(zhuǎn)染效率約65%，見圖2A；在OHP-HCT 116細(xì)胞，與MOCK組及siNC組比較，pEGFP-NDRG1-N3組NDRG1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，轉(zhuǎn)染效率約70%，見圖2B。

2.3 上調(diào)NDRG1表達(dá)對HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞存活率的影響 分別以不同濃度梯度(0、10、20、40、80 μmol/L)的奧沙利鉑干擾HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞，以MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，在HCT 116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-NDRG1-N3細(xì)胞存活率下降，在濃度為40、80 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。在OHP-HCT 116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-NDRG1-N3細(xì)胞存活率下降，在濃度為40、80 μmol/L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。結(jié)果表明，上調(diào)NDRG1表達(dá)能降低結(jié)腸癌細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的存活率，這種效應(yīng)具有奧沙利鉑劑量依賴性。

2.4 上調(diào)NDRG1表達(dá)對HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)顯示，與MOCK及siNC組比較，HCT 116組及pEGFP-NDRG1-N3 OHP-HCT 116組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 以qRT-PCR及Western blot對pEGFP-NDRG1-N3在結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞(A)及OHP-HCT 116細(xì)胞中(B)轉(zhuǎn)染效率檢測

表1 不同濃度奧沙利鉑處理的HCT 116細(xì)胞存活率變化(%)

表2 不同濃度奧沙利鉑處理的OHP-HCT 116細(xì)胞存活率變化(%)

圖3 上調(diào)NDRG1表達(dá)對HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞凋亡的影響

2.5 上調(diào)NDRG1表達(dá)對p53、Bcl-2蛋白的影響 Bcl-2、p53是mTOR通路重要蛋白之一，為了驗證NDRG1是否通過mTOR信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡及奧沙利鉑耐藥，采用Western blot檢測上調(diào)pEGFP-NDRG1-N3表達(dá)HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞Bcl-2及p53蛋白表達(dá)水平的變化。

結(jié)果顯示，與MOCK及siNC組比較，p53在HCT116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞表達(dá)升高(P<0.05)見圖4A；與MOCK及siNC組比較，Bcl-2在HCT 116細(xì)胞及OHP-HCT 116細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4B。

圖4 Western blot檢測上調(diào)NDRG1表達(dá)Bcl-2及p53蛋白水平變化

3 討論

結(jié)直腸惡性腫瘤治療中，由于奧沙利鉑化療的引入，晚期結(jié)直腸癌的無病生存期及總生存率均有一定程度提高，但結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥也是導(dǎo)致化療進(jìn)行到一定階段治療效果減弱及喪失的主要原因[6-7]。靶向藥物與化療進(jìn)行綜合治療能夠進(jìn)一步延長患者無病生存時間，并可能延長化療藥物耐藥出現(xiàn)的時間[8-9]。有研究顯示，NDRG1在肺癌、宮頸癌及卵巢癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)低于正常組織，在結(jié)直腸癌中NDRG1表達(dá)也低于正常結(jié)直腸組織[10-11]。毛志海等[12]研究認(rèn)為，在結(jié)直腸惡性腫瘤中，NDRG1是抑癌基因，對結(jié)直腸癌患者預(yù)后風(fēng)險具有判斷價值。NDRG1對腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡及增殖等具有調(diào)控作用，可能作為抑癌基因，通過對下游通路的調(diào)控介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。因此，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中對NDRG1進(jìn)行上調(diào)，可能成為潛在的治療靶基因。

本研究對奧沙利鉑在結(jié)腸癌細(xì)胞及HCT 116奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株的毒性作用進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了奧沙利鉑耐藥HCT 116細(xì)胞，pEGFP-NDRG1-N3轉(zhuǎn)染也達(dá)到了50%以上的效率，進(jìn)一步細(xì)胞存活率實驗顯示，HCT 116細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥的HCT 116細(xì)胞在上調(diào)了NDRG1表達(dá)后，均表現(xiàn)出了存活率下降及凋亡率增高，奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株的耐藥性也得到了部分逆轉(zhuǎn)，說明上調(diào)NDRG1表達(dá)能夠降低結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞的增殖活性，增加其凋亡，對奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的耐藥性也具有一定逆轉(zhuǎn)作用。研究顯示，對宮頸癌SiHa細(xì)胞NDRG1表達(dá)進(jìn)行上調(diào)，宮頸癌細(xì)胞增殖活性減低，這種減低可能是NDRG1調(diào)控COX-2及VEGF表達(dá)實現(xiàn)的[13]。在肺腺癌A549細(xì)胞中的研究顯示，上調(diào)A549細(xì)胞中NDRG1表達(dá)后細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，可能是通過調(diào)控p21及MDM2表達(dá)實現(xiàn)對A549細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控。毛志海等[14]研究認(rèn)為，NDRG1可能是通過激活下游的PAK1表達(dá)介導(dǎo)MLC2磷酸化，抑制F-actin占主體的細(xì)胞骨架重構(gòu)而對結(jié)直腸癌遷移行為進(jìn)行調(diào)控。另有研究認(rèn)為，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)從上游調(diào)控NDRG1表達(dá)，從而介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞分化能力[15]。本研究顯示，NDRG1表達(dá)上調(diào)后，在HCT 116細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥的HCT 116細(xì)胞中p53表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低。p53作為抑癌基因，在細(xì)胞周期G期對DNA的完整性進(jìn)行監(jiān)視，對DNA損傷而不能修復(fù)細(xì)胞誘發(fā)凋亡[16]，p53對Bcl-2具有特異性的抑制作用，p53水平的升高抑制了Bcl-2的表達(dá)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。本研究顯示，上調(diào)NDRG1表達(dá)后p53及Bcl-2水平均發(fā)生了改變，這表明，NDRG1可能對p53具有直接或間接調(diào)控作用，繼而抑制了Bcl-2表達(dá)降低，從而細(xì)胞凋亡增加。NDRG1對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的控制可能是多基因多通路共同參與的，包括對下游mTOR通路調(diào)控，并接受上游基因的調(diào)控等[18-20]。

本研究觀察了上調(diào)NDRG1對奧沙利鉑干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性作用，結(jié)論為上調(diào)NDRG1通過p53對結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑化療增效，并對奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性具有改善作用，但NDRG1對奧沙利鉑干預(yù)的結(jié)腸癌細(xì)胞及奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。