異甘草素抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

石玉花，李瑞萍，陳小蕓，楊 艷，郭鈺珍

0 引言

異甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)，又名2,2,4-三羥基查耳酮，是從豆科植物甘草、脹果甘草以及光果甘草根莖中提取的黃酮類(lèi)化合物，其分子式為C15H12O4。近年來(lái)，關(guān)于異甘草素的藥理作用研究成為熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素在抗腫瘤、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、治療心律失常以及保肝等方面有重要作用。

國(guó)內(nèi)外眾多研究顯示，異甘草素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤[1-5]、口腔癌[6-8]、肺癌[9-13]、乳腺癌[14-19]、肝癌[20]、胃癌[21-22]、胰腺癌[23]、結(jié)直腸癌[24-26]、腎癌[27]、膀胱癌[28]、前列腺癌[29]以及女性常見(jiàn)的卵巢癌[30-33]、子宮內(nèi)膜癌[34]和宮頸癌[35-36]等均表現(xiàn)出良好的抗癌活性，其抗癌機(jī)制為多類(lèi)型的，可以從癌細(xì)胞的形成、增殖、遷移以及誘導(dǎo)凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮抗癌作用，本文就異甘草素的抗腫瘤作用及可能的機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為異甘草素的深入研究和抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 阻滯細(xì)胞分裂周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Hsia等[7]在研究ISL對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)的抗癌作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL可誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞周期G2/M期阻滯、細(xì)胞凋亡和DNA損傷。DNA修復(fù)相關(guān)的毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因(ATM)和磷酸化ATM也被下調(diào)，認(rèn)為ATM被ISL激活的caspase分解，從而抑制OSCC細(xì)胞中的DNA修復(fù)，引起OSCC 的凋亡。陳利軍等[37]探討ISL對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和 KYSE450的影響及其作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL抑制食管鱗癌細(xì)胞EC9706與KYSE450的增殖與其劑量呈正比例關(guān)系，ISL還可將此兩種細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，并且顯著下調(diào)細(xì)胞中 IGF-1R表達(dá)，抑制下游PI3K/AKT和 RAS/MAPK信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抗食管癌活性。Zhou等[12]的研究結(jié)果表明，含有ISL的活性提取物可上調(diào)組織中p53、p21、促凋亡成員Bax、Bid蛋白的表達(dá)和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并通過(guò)增加啟動(dòng)子caspase-8和caspase-9的酶活性來(lái)激活效應(yīng)子caspase-3和caspase-7，導(dǎo)致內(nèi)在細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)激活，從而引起非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡。

Si等[28]發(fā)現(xiàn)，ISL在體外誘導(dǎo)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2(CDK2)活性升高、線(xiàn)粒體膜電位下調(diào)和caspase-3/caspase-9介導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路激活有關(guān)。Zhang等[29]研究ISL在人前列腺癌PC-3和22RV1細(xì)胞中的抗癌功效和相關(guān)機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL可在體外引起G2/M細(xì)胞周期停滯，并抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其使用微陣列轉(zhuǎn)錄分析來(lái)鑒定前列腺癌PC-3細(xì)胞上的ISL調(diào)節(jié)基因。經(jīng)過(guò)ISL處理后，參與細(xì)胞周期、DNA損傷和凋亡信號(hào)通路的多個(gè)基因發(fā)生了顯著變化。分子研究顯示，G2/M阻滯與細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)和磷酸化CDK1(Thr14，Tyr15和Thr161)的減少有關(guān)，同時(shí)與14-3-3sigma的表達(dá)增加和DNA損傷誘導(dǎo)的45α(GADD45A)增加有關(guān)。此外，研究者用較高濃度ISL處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其主要與增強(qiáng)凋亡調(diào)節(jié)因子(Bax/Bcl-2)的比例有關(guān)。結(jié)果表明，ISL調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白B1與CDK1使得細(xì)胞于G2/M期停滯，并增強(qiáng)凋亡因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。Chen等[31]研究ISL對(duì)人卵巢癌的抗腫瘤作用時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，表明ISL誘導(dǎo)卵巢癌OVCAR5細(xì)胞G2/M期阻滯。Wu等[34]研究表明，ISL處理人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(Ishikawa，HEC-1A和RL95-2細(xì)胞)后，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞停滯于G1或G2/M期，從而抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Hirchaud等[35]研究ISL對(duì)人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞Ca Ski、SiHa、HeLa和C-33A的抗增殖和凋亡活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL可以降低癌細(xì)胞活力、誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞積聚和4種癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)改變。在Ca Ski細(xì)胞中，ISL導(dǎo)致HPV16 E6、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而p53、p21和Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bid觸發(fā)線(xiàn)粒體膜電位消散，使其釋放細(xì)胞色素C至細(xì)胞質(zhì)后激活半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，裂解caspase-9、caspase-3、caspase-8和PARP，引起宮頸癌細(xì)胞的凋亡。以上發(fā)現(xiàn)拓寬了對(duì)ISL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡分子基礎(chǔ)的理解。

2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬

Wang等[15]研究表明，ISL可增強(qiáng)阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的化療敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。Jin等[26]研究ISL在結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞中的抗癌機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn) ISL可誘導(dǎo)人HCT-116細(xì)胞凋亡并引起p62/SQSTM1 mRNA和蛋白的表達(dá)，p62/SQSTM1是與自噬相關(guān)的最常見(jiàn)的標(biāo)志物。結(jié)果表明，ISL誘導(dǎo)p62/SQSTM1上調(diào)從而減弱CRC細(xì)胞中胱天蛋白酶-8活化而影響ISL介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡。張棟棟等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，ISL對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，其抗體外腫瘤機(jī)制可能與激活線(xiàn)粒體凋亡通路及自噬通路相關(guān)。Yushan等[38]在探索ISL對(duì)鼠肉瘤S180細(xì)胞的作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL不能直接體外抑制S180的生長(zhǎng)，但是可抑制體內(nèi)S180腫瘤細(xì)胞的體積。NK細(xì)胞中的TNF-α被siRNA敲除時(shí)，ISL對(duì)S180腫瘤沒(méi)有抑制作用。通過(guò)FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ISL可增強(qiáng)NK細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，自噬相關(guān)蛋白LC3-II、Beclin-1、ATG-7在與ISL處理的NK細(xì)胞共培養(yǎng)的S180細(xì)胞中升高。當(dāng)TNF-α被siRNA敲低時(shí)，ISL不能在S180腫瘤中誘導(dǎo)自噬。在骨肉瘤患者的NK細(xì)胞中，通過(guò)ELISA檢測(cè)，TNF-α與GSK-3β呈負(fù)相關(guān)，ISL可以抑制GSK-3β的表達(dá)，并進(jìn)一步增加NK細(xì)胞中p65和c-Rel的表達(dá)，但當(dāng)細(xì)胞中的GSK-3β被siRNA敲除時(shí)，ISL并不影響p65和c-Rel的表達(dá)。這是因?yàn)镮SL可以直接抑制GSK-3β，然后激活NF-κB通路，增強(qiáng)NK細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肉瘤自噬。Yang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，ISL也可誘導(dǎo)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC-12細(xì)胞)發(fā)生自噬，達(dá)到治療嗜鉻細(xì)胞瘤的作用。Yang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可誘導(dǎo)自噬引起人表皮黑色素細(xì)胞退化，從而治療黑色素瘤，其作用與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

3 抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

Dang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可能通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Hu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞(OSCC-CSCs)侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)為集落的能力，并且能夠增強(qiáng)化療藥物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的敏感性。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ISL介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用是由細(xì)胞骨架重組和黏著斑組裝受損引起的，是因?yàn)镮SL代謝產(chǎn)物干擾了Src激酶。Wang等[17]研究ISL對(duì)巨噬細(xì)胞M2表型極化的調(diào)控作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL可以逆轉(zhuǎn)M2表型巨噬細(xì)胞的極化，并通過(guò)提高 miR155表達(dá)和抑制 STAT3/6 信號(hào)通路活化，從而影響精氨酸酶 1(Arg-1)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和血紅素加氧酶 1(HO-1)的表達(dá)，達(dá)到抑制M2巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。

4 抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生

乳腺癌干細(xì)胞(CSCs)是乳腺腫瘤發(fā)生的根源。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可以減少CSCs群，抑制體內(nèi)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。其通過(guò)全局基因表達(dá)譜測(cè)定法鑒定了WIF1為ISL治療的主要應(yīng)答基因，可引起β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的下調(diào)和乳腺CSCs中的G0/G1期阻滯。并用甲基化分析進(jìn)一步揭示了ISL通過(guò)促進(jìn)其啟動(dòng)子的去甲基化來(lái)增強(qiáng)WIF1基因表達(dá)，這與DNMT1甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制密切相關(guān)，分子對(duì)接分析顯示，ISL可以穩(wěn)定地進(jìn)入DNMT1的催化結(jié)構(gòu)域。以上研究證明，ISL可以作為膳食補(bǔ)充劑用于抑制乳腺癌的發(fā)生。劉方康等[22]研究表明，ISL通過(guò)誘導(dǎo)分化和抑制增殖對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSCs)具有抗腫瘤作用。Zhao等[25]認(rèn)為，M2巨噬細(xì)胞極化與結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān)，他們以氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤發(fā)生的小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)ISL下調(diào)PGE2和IL-6信號(hào)傳導(dǎo)限制了M2巨噬細(xì)胞的極化，有效抑制了結(jié)腸炎相關(guān)的腫瘤發(fā)生。

5 引起腫瘤細(xì)胞凋亡作用

有研究認(rèn)為，ROS可通過(guò)外在細(xì)胞死亡受體和內(nèi)在線(xiàn)粒體細(xì)胞死亡途徑引起細(xì)胞凋亡[41]，因此，ROS形成增加和隨后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是一種治療癌癥的新方法[42]。Hou等[8]在研究ISL抑制舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的增殖實(shí)驗(yàn)中，用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS時(shí)發(fā)現(xiàn)ROS降低。說(shuō)明ISL抑制Tca8113的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)其凋亡的作用可能與抗氧化有關(guān)。而Kim等[27,41]的研究認(rèn)為，ISL通過(guò)使細(xì)胞產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)腎癌Caki細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC-12細(xì)胞)凋亡，其機(jī)制分別可能與誘導(dǎo)p53的產(chǎn)生、抑制STAT3信號(hào)通路和引起線(xiàn)粒體-細(xì)胞色素C-caspase蛋白酶內(nèi)在機(jī)制的激活有關(guān)。閻新燕等[43]的研究中，ISL能夠抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞的惡性增殖，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，推測(cè)其作用機(jī)制可能是ISL通過(guò)引起活性氧升高、線(xiàn)粒體膜電勢(shì)下降，從而影響 A375 細(xì)胞的糖酵解途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。所以在ISL是減低細(xì)胞中活性氧還是增加細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生從而引起腫瘤細(xì)胞的凋亡這一機(jī)制上需要進(jìn)一步的研究。

6 多種機(jī)制的抗腫瘤作用

Tian等[9]在探究ISL抑制肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)ISL顯著下調(diào)A549細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)，并上調(diào)N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示。ISL處理A549細(xì)胞后凋亡顯著增加，促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白和活性caspase-3的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白表達(dá)降低。ISL處理的細(xì)胞中，磷酸化AKT和雷帕霉素靶點(diǎn)蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖蛋白P70和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)顯著降低。由此得出ISL對(duì)A549細(xì)胞的增殖和遷移具有顯著的抑制作用，并且可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。該機(jī)制可能涉及A549細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其可能是治療肺癌的潛在治療靶標(biāo)。Zhang等[21]研究了ISL對(duì)MKN28胃癌細(xì)胞的作用和潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ISL可能通過(guò)抑制磷酸肌醇3激酶/AKT/mTOR(PI3K-AKT-mTOR)信號(hào)通路，影響MKN28細(xì)胞的凋亡、自噬、增殖、遷移和侵襲。Li等[30]觀(guān)察到ISL對(duì)卵巢癌SKOV3和OVCAR3細(xì)胞的遷移、侵襲有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ISL處理增加了SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中Bax/Bcl-2的比率，表明線(xiàn)粒體凋亡途徑被觸發(fā)。他們還觀(guān)察到用ISL處理細(xì)胞后，Akt和mTOR的磷酸化形式減少，GSK3β的表達(dá)增加，而P70/S6K減少。ISL還通過(guò)降低Ishikawa和ES-2細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR、P70/S6K和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平來(lái)抑制PI3K/Akt/mTOR途徑。這些結(jié)果表明，ISL通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)SKOV3和OVCAR3細(xì)胞的凋亡。Chen等[44]的研究也發(fā)現(xiàn)，ISL可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，延緩骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

7 其他途徑抗腫瘤作用

現(xiàn)有的理論認(rèn)為，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生與多種遺傳改變相關(guān)，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的突變。Jung等[11]在體外測(cè)定激酶結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ISL可以抑制野生型和雙突變體(L858R/T790M)EGFR的催化活性。ISL還降低了NSCLC細(xì)胞中Akt和ERK1/2的磷酸化，并減弱了Akt1和ERK2的激酶活性。ISL通過(guò)與EGFR及其下游信號(hào)激酶Akt1和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2相互作用抑制其催化活性，從而抑制并誘導(dǎo)EGFR敏感性或EGFR耐藥性肺癌細(xì)胞的凋亡。Peng等[14]認(rèn)為，ISL通過(guò)降低miR-374a表達(dá)來(lái)抑制異常Akt信號(hào)傳導(dǎo)并增加PTEN表達(dá)的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡負(fù)向調(diào)節(jié)乳腺癌的生長(zhǎng)。Zheng等[18]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和酶裂解檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)，ISL在MDA-MB-231和BT-549人乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)失巢凋亡，可能是通過(guò)抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)和細(xì)胞色素P450(CYP)4A信號(hào)傳導(dǎo)并降低乳腺癌細(xì)胞中前列腺素E2(PGE2)、20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)和磷酸-Akt[Thr(308)]的分泌來(lái)發(fā)揮抗癌作用的。Li等[20]和Zhao等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，ISL可逆性抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Top I)的活性，降低腫瘤細(xì)胞的解旋率，在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中起重要作用。目前的研究認(rèn)為，腸道菌群的失調(diào)與結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌(CAC)有關(guān)，中藥逐漸被用于調(diào)整腸道微生物群。Wu等[24]的研究中，使用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)誘導(dǎo)CAC小鼠模型(CACM)，評(píng)估ISL對(duì)CAC發(fā)育和腸道微生物群的影響。組織病理學(xué)分析表明，ISL降低了體內(nèi)腫瘤發(fā)生率。與對(duì)照小鼠(CK)中的微生物群相比，CAC小鼠發(fā)育期間，腸道中擬桿菌的水平降低，而厚壁菌門(mén)的水平增加。筆者認(rèn)為，ISL逆轉(zhuǎn)了菌群的不平衡，改變了腸道微生物群的家族成分。用高劑量ISL處理小鼠后，腸道中螺旋桿菌科的數(shù)量增加，而毛螺菌科和理研菌科的數(shù)量下降。在菌群屬的水平上，ISL減少了機(jī)會(huì)致病菌(埃希氏菌和腸球菌)的水平，而增加了益生菌的水平，特別是產(chǎn)丁酸鹽的菌群(丁酸梭菌、梭菌和瘤胃球菌)。因此，認(rèn)為ISL保護(hù)小鼠免受AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC，并且ISL和腸道微生物群具有協(xié)同的抗癌作用。

8 小結(jié)

本文基于已有的研究，綜述了異甘草素抗腫瘤的作用及可能的機(jī)制，作用涉及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡各個(gè)過(guò)程，但都未完全明確，需要在這些可能的機(jī)制基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，得到更多有效的抗腫瘤靶點(diǎn)并明確ISL抗腫瘤的機(jī)制，且其天然、安全、經(jīng)濟(jì)易得，其能否應(yīng)用于腫瘤的輔助治療，需要我們更多的探索。