過表達microRNA-144通過靶向調節泛素樣PHD和環指結構域1基因誘導非小細胞肺癌凋亡

張冉冉，張月怡，宮 錚，李 波*

0 引言

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的一種主要類型[1]，約占所有肺癌病例數目的80%[2]。近年來，分子靶向藥物開發成為研究重點，有助于提高癌癥患者的整體生存率和生活質量[3]。然而，肺癌發病機制的分子基礎尚不清楚。因此，探尋有效的NSCLC治療方法，尋找新的、有前景的靶基因勢在必行。

微小RNA(miRNAs)是一種廣泛存在于各種生物體內的非編碼RNA[4]，可作為基因表達的負調控因子，靶向誘導mRNA降解或抑制翻譯過程，從而參與細胞分化、增殖、凋亡等多種過程[5]。研究表明，異常表達的miRNA能對NSCLC的發生發展過程發揮致癌或抑癌作用[6]。miRNA正在成為NSCLC治療中新的潛在治療靶點[7]。因此，發現新的參與NSCLC病理過程中關鍵miRNA尤為重要。

UHRF1通過參與DNA損傷及修復參與多種疾病的發生發展，如NSCLC[8]。本課題組前期結果表明，UHRF1能夠通過調控Wnt/β-catenin信號通路，抑制NSCLC細胞增殖。然而，miR-144與UHRF1對于NSCLC的關系鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與細胞轉染 人非小細胞肺癌細胞系(A549)購自American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA，USA)。miR-144 mimic、miR-144 inhibitor以及陰性對照物(NC)購自廣州RiboBio Co.,Ltd(廣州，中國)。細胞轉染使用lip2000轉染試劑盒。

1.2 檢測miRNA表達 使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)從臨床組織或培養細胞中提取總miRNA，按說明書使用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)進行逆轉錄。使用TaqMan microRNA檢測試劑盒(Applied Biosystems)實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-144表達。U6作為相對miR-1179表達正常化的內參。

1.3 細胞活性實驗 采用CCK-8細胞活性試劑盒(廣州RiboBio有限公司)測定細胞活性能力。按照說明書的操作流程，轉染相應miRNA 48 h后，加入5 mg/ml CCK-8溶液(10 ml/孔)的新鮮培養基替代。將細胞在37 ℃暗處培養4 h。酶標儀(美國加州森尼維爾市分子裝置公司)在570 nm處測定溶液吸光度。

1.4 靶向熒光素酶檢測 將攜帶預測miR-144結合位點的3′-UTR片段插入pmirGLO質粒(Promega，Madison，WI，USA)中，以生成靶點熒光素酶基因。將293T細胞接種到24孔板上，與熒光素酶載體和miR-144 mimic或NC陰性對照共轉染48 h。制備細胞提取物，根據說明書使用雙熒光素酶檢測系統(Promega)測定熒光素酶活性。

1.5 qRT-PCR分析mRNA表達 用TRIzol試劑提取總RNA，用TaqMan逆轉錄試劑(Applied Biosystems)逆轉錄成cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統上進行cDNA擴增，并配以合適的引物。GAPDH作為基準用于標準化相關基因表達。

1.6 免疫蛋白印跡實驗 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物裂解細胞，制備細胞總裂解蛋白。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜放在5%脫脂牛奶中37 ℃封閉1 h，然后與一抗UHRF1(Abcam，Cambridge，MA，USA)、PCNA及Bax(Cell signaling technology，Danvers，MA，USA)和GAPDH 4 ℃孵育過夜。室溫用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗將上述膜孵育1 h。最后，用免疫印跡化學發光底物(Thermo Fisher Scientific，Inc.)構建蛋白條帶。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對蛋白條帶進行分析。

1.7 γH2xa染色 將A549細胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中。miR-144 mimic及其對應的NC 轉染48 h。將Ki67抗體以及γH2ax(Cell signaling technology，USA)抗體室溫孵育1 h后，加入相應的熒光顯色劑室溫孵育20 min。DIPA染細胞核5 min。免疫熒光顯微鏡進行相應的細胞拍攝。

1.8 吖啶橙/溴化乙錠熒光染色 A549細胞用吖啶橙/溴化乙錠混合液(1∶1)孵育5 min(索萊寶生物技術公司，中國)。用熒光顯微鏡(200×)觀察細胞形態變化。凋亡細胞百分比的計算公式如下：凋亡率(%)=凋亡細胞數/所有計數細胞數。

2 結果

2.1 miR-144以及UHRF1在NSCLC患者組織中的表達 TCGA數據庫中miR-144在NSCLC患者癌與癌旁標本中明顯低于癌旁(圖1A)。高表達miR-144組的NSCLC患者生存率明顯高于低表達miR-144組(圖1B)。同時，TCGA數據庫中UHRF1在NSCLC患者癌與癌旁標本中，在不同人種、不同性別、不同年齡以及是否有吸煙史，明顯高于癌旁組織(圖1C～圖1G)。且高表達UHRF1 對于NSCLC患者生存率明顯低于低表達UHRF1組(圖1H)。同時，miR-144與UHRF1在NSCLC患者中表達呈負相關(圖1I)。

2.2 miR-144對于A549細胞活性的影響 qRT-PCR檢測miR-144在A549細胞中的轉染效率；miR-144 mimic組中miR-144表達明顯高于NC組(圖2A)。CCK-8結果表明，低表達miR-144能夠明顯促進A549的活性，而高表達miR-144抑制A549細胞的活性(圖2B)。Ki67結果顯示，過表達miR-144能夠明顯抑制A549活性(圖2C)。γH2a染色結果表明，過表達miR-144組中γH2a表達明顯高于NC組(圖2D)。Western blot結果顯示，過表達miR-144后，PCNA以及Bax蛋白相對于NC組明顯下調，Bcl-2蛋白明顯上調(圖2E)。

2.3 UHRF1是miR-144的靶基因 為研究miR-144調節NSCLC細胞活性的作用機制，分析與miR-144有結合位點的潛在靶基因。結果顯示，UHRF1 3′端與miR-144有結合位點(圖3A)。通過熒光素酶檢測實驗確定miR-144是否直接結合UHRF1的3′端非編碼區。結果顯示，過表達miR-144明顯降低了UHRF1-WT的熒光素酶活性；而UHRF1-Mut阻斷了miR-144的調節作用(圖3B)。為驗證A549細胞中UHRF1是否為miR-144的直接靶點，我們通過qRT-PCR和Western blot檢測了轉染miR-144類似物組或抑制劑后，A549細胞中UHRF1有表達。qRT-PCR顯示，miR-144類似物顯著下調了UHRF1 mRNA的表達，而miR-144抑制劑上調了其表達(圖3C)。Western blot檢測到轉染了miR-144類似物的細胞中UHRF1蛋白表達水平下降，而miR-144抑制劑顯著增加了UHRF1蛋白表達(圖3D)。

圖1 miR-144以及UHRF1在NSCLC患者中表達及對預后的影響

注：A.miR-144在肺癌患者中的表達；B.不同表達的miR-144對于肺癌患者生存率的影響；C～G.UHRF1對不同人種、性別、年齡及吸煙史NSCLC患者的影響；H.UHRF1在NSCLC患者生存率；I.miR-144與UHRF1在NSCLC患者中的表達

圖2 miR-144對A549細胞活性的影響

A.qRT-PCR檢測轉染miR-144轉染效率；B.CCK-8檢測不同表達的miR-144對于A549細胞的活性影響；C.AO/EB染色過表達miR-144后對A549細胞凋亡能力的影響；D.γH2a染色檢測過表達miR-144對A549細胞的DNA損傷的能力；E.Western blot 檢測過表達miR-144對A549細胞中PCNA、Bcl-2及Bax蛋白的變化。*P<0.05

3 討論

miR-144在多種癌癥中存在差異表達。miRNA深度測序分析顯示，過表達miR-144能夠抑制膠質母細胞瘤細胞侵襲性以及提高化療耐藥性[9]。miR-144能夠通過靶向增強子結合蛋白4抑制前列腺癌細胞增殖[10]。此外，最近研究顯示，miR-144通過下調Smad4抑制結腸癌的生長和轉移[11]，表明miR-144作為一個抑癌基因，參與腫瘤的病理生理過程。本研究結果表明，miR-144在NSCLC中表達下調，過表達miR-144抑制了NSCLC細胞的生長，且低表達miR-144 NSCLC患者生存率較高。結果表明，miR-144對腫瘤具有抑制作用。

有報道，γ-H2ax被ATM磷酸化，以進一步招募BRCA1和TP53bp1等，并在DNA斷裂位點周圍形成支架[12]。然后，ATM/ATR激酶將DNA損傷信號轉導到下游通路，如細胞周期、DNA修復或凋亡[13]。miRNA能夠調控γ-H2ax表達進而影響細胞凋亡[14]。本研究結果表明，過表達miR-144能夠誘導A549細胞中γ-H2ax表達升高，導致DNA損傷誘導細胞凋亡。

圖3 UHRF1是miR-144的靶基因

綜上所述，本研究證實了miR-144在NSCLC中具有抑癌作用。功能性研究表明，miR-144通過靶向UHRF1調控γ-H2ax表達，進而抑制NSCLC活性，誘導細胞凋亡。因此，miR-144/UHRF1通路可能為治療NSCLC提供新的潛在治療方法。