高脂血癥大鼠模型制備方法的探索性研究*

付滿玲，姚淮育，胡月，郭輝夢

（1.西南醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000；2.四川省瀘州市人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川 瀘州 646000）

高脂血癥是人體脂代謝失常所致的一種常見代謝疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）水平高于正常和/或高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）低于正常水平的狀態(tài)，則為脂質(zhì)異常血癥［1］。隨著人們生活水平的提高，中國人群血脂總體異常患病率高達(dá)40%，高脂血癥易誘發(fā)冠心病、腦卒中等疾病［2］，其中LDL-C 水平的顯著升高，會使高脂血癥患者處于復(fù)發(fā)性心血管不良事件的極端危險中［3］，嚴(yán)重危害到人們的身體健康。因此，盡早診斷出高脂血癥并加以控制，對改善高脂血癥患者的預(yù)后有重要意義［4］。但如何有效的控制血脂仍是目前亟待解決的課題。本研究通過灌飼高脂乳劑，使大鼠形成與人類相類似的高脂血癥，為后續(xù)進(jìn)行山楂茶降脂效果的研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 SPF 級SD 雌性大鼠8 只，體重（200±20） g，西南醫(yī)大動物中心提供［SCXK（川）2013-17］。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組4 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，已通過西南醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)審查，遵照動物福利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 吐溫-80（成都市科龍化工試劑廠）、脫氧膽酸鈉（北京奧博星生物技術(shù)公司）、丙硫氧嘧啶（護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室提供）、無水乙醇（重慶川東化工有限公司）、生理鹽水（四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司）、甲醛（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供）、戊苯巴比妥鈉（護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室提供）、豬油（自制）。

1.2 方法

1.2.1 制備高脂乳劑 本實(shí)驗(yàn)配方參照郭建等［5］、周星等［6］的配方并加以改進(jìn)，具體方法如下：豬油30 g、膽固醇10 g、丙硫氧嘧啶1 g、脫氧膽酸鈉5 g、吐溫-80 20 g 以及蒸餾水64 g，用適量蒸餾水溶解脫氧膽酸鈉，取膽固醇及丙硫氧嘧啶分別置于乳缽中研細(xì)備用。取豬油于40℃水浴中加熱融化，加入膽固醇、丙硫氧嘧啶、充分?jǐn)嚢瑁芙猓煨旒尤肴芙夂玫拿撗跄懰徕c溶液，并不斷攪拌，然后加入吐溫-80，研磨乳化均勻，最后加入剩余的蒸餾水，裝入密閉的容器中，冷藏，使用時置于37℃水浴融化。

1.2.2 建立模型 SD 雌性大鼠8 只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組各4 只，體重（200±20）g。實(shí)驗(yàn)組：自制50.7% 高脂乳劑每日1.3 mL/100 g，連續(xù)灌喂35 d；對照組：0.9% 氯化鈉溶液每日1.3 mL/100 g，連續(xù)灌喂35 d。

1.3 觀察指標(biāo)

①一般情況：體重、進(jìn)食量、有無死亡；②血液生化指標(biāo)：HDL-C、TC、LDL-C、TG；③處死后觀察：肝臟顏色、質(zhì)地、肝臟重量、病理學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料采用 均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對進(jìn)食量、體重進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，肝重、血清指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂乳劑對大鼠進(jìn)食量的影響

2.1.1 大鼠進(jìn)食量變化 實(shí)驗(yàn)組、對照組進(jìn)食量呈鋸齒狀變化，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)食量始終低于對照組進(jìn)食量，見圖1。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)食量比較 實(shí)驗(yàn)組進(jìn)食量低于對照組進(jìn)食量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=162.012，P＜0.001），故灌喂自制高脂乳劑會導(dǎo)致大鼠基礎(chǔ)飼料的進(jìn)食量降低。不同時間點(diǎn)進(jìn)食量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.721，P=0.073），見表1。

2.2 高脂乳劑對大鼠體重的影響

2.2.1 大鼠體重變化 對照組大鼠體重呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)組體重呈先上升后下降的趨勢；對照組體重總體高于實(shí)驗(yàn)組體重，見圖2。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)組與對照組體重比較 實(shí)驗(yàn)組與對照組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.221，P=0.052），故灌喂高脂乳劑對大鼠體重影響不明顯；不同時間點(diǎn)兩組體重差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.374，P=0.016），見表2。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)食量變化趨勢圖

表1 兩組不同時間點(diǎn)進(jìn)食量比較 （ ± s，g）

表1 兩組不同時間點(diǎn)進(jìn)食量比較 （ ± s，g）

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對照組體重變化趨勢圖

表2 兩組不同時間點(diǎn)體重比較 （ ± s，g）

表2 兩組不同時間點(diǎn)體重比較 （ ± s，g）

2.3 高脂乳劑對大鼠肝重的影響

對照組肝重為（7.20±0.51）g，實(shí)驗(yàn)組肝重為（7.55±0.58）g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.906，P=0.400），故灌喂自制高脂乳劑對大鼠肝重?zé)o明顯影響。

2.4 高脂乳劑對大鼠血清TC、LDL-L、HDL-C、TG 的影響

實(shí)驗(yàn)組與對照組HDL-C、TC、LDL-C 的含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與對照組TG 的含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。故灌喂高脂乳劑能影響大鼠血脂水平。

2.5 小鼠死亡情況

各組小鼠均無死亡。

2.6 組織病理學(xué)檢查

取大鼠新鮮肝臟置于10% 甲醛溶液中固定，經(jīng)浸蠟、包埋、貼片、切片、H-E 染色等處理后光鏡下觀察大鼠病理組織切片。灌喂高脂乳劑35 d 后，對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，大小均勻一致，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則、排列整齊，肝竇清晰可見，見圖3A。實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂變，排列紊亂，形態(tài)大小各異，內(nèi)充滿大小不等的脂滴空泡，將細(xì)胞核擠向一側(cè)，見圖3B；且肝細(xì)胞重度脂變并出現(xiàn)碎片狀壞死，見圖3C、3D。從脂滴分布來看，對照組無脂滴，實(shí)驗(yàn)組脂滴空泡主要集中于肝小葉周邊部，在小葉中央靜脈附近區(qū)域分布較少，見圖3E、3F。

表3 大鼠血清觀察指標(biāo)分析 （ ± s，mmol/L）

表3 大鼠血清觀察指標(biāo)分析 （ ± s，mmol/L）

圖3 灌喂高脂乳劑后大鼠的組織病理學(xué)檢查

3 討論

進(jìn)行降脂研究的前提是建立與人類高脂血癥發(fā)病機(jī)制相類似的高脂動物模型。大鼠是目前國內(nèi)外研究脂質(zhì)代謝、高脂血癥過程中最廣泛使用的一種模型動物，具有成本低廉、易于大批繁殖、易于飼養(yǎng)管理、抵抗力極強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于多種疾病模型的復(fù)制及病理生理過程的模擬，實(shí)驗(yàn)操作簡便、易于造模、重復(fù)效果好、模型穩(wěn)定性好、易于控制各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件、取材方便可滿足大量指標(biāo)檢測等優(yōu)點(diǎn)［7］。大鼠在高脂血癥相關(guān)各項(xiàng)研究中，因能較好地反映各種實(shí)驗(yàn)因素對其脂質(zhì)的吸收、分解及合成等代謝環(huán)節(jié)的影響，因而被作為高脂血癥模型動物，廣泛用于降脂藥物的研究開發(fā)［8］。

常用的制備高脂血癥的方法有：喂飼高脂飼料和高脂乳劑兩種方法［9］。喂飼高脂飼料的特點(diǎn)是：對大鼠的額外刺激少，造模穩(wěn)定，但是造模周期長，大多在兩到三個月才能將模型制備成功［10］。另外，各個大鼠進(jìn)食量存在差異，使模型的制備增加了許多不確定因素。與喂飼高脂飼料相比，雖在灌喂過程中對大鼠存在一定的刺激，但該方法能夠有效控制大鼠的灌喂量，通過灌喂高脂乳劑，造模周期短，每天定時、定量灌飼高脂乳劑，可以減少各個老鼠之間進(jìn)食的差異，減少實(shí)驗(yàn)誤差的產(chǎn)生。綜上考慮，灌喂高脂乳劑能夠更好地為山楂代用茶降脂效果的基礎(chǔ)研究提供穩(wěn)定的高脂血癥大鼠模型。

針對高脂血癥的治療，西醫(yī)使用辛伐他汀［11］、瑞舒伐他汀鈣等藥物治療［12］，輔以運(yùn)動、飲食調(diào)整［13］。有研究表明，使用他汀類藥物治療高脂血癥，不良反應(yīng)發(fā)生率高，是導(dǎo)致心血管疾病的一個危險因素［14-15］。中醫(yī)提倡復(fù)方治療，聯(lián)合耳穴、針灸、艾灸等方法［16-18］，治療效果好，副作用少，山楂代用茶系瀘州岷宏科技有限公司自主研發(fā)“藥食同源”中藥復(fù)方，此次高脂血癥模型制備的篩選是為山楂代用茶藥理學(xué)驗(yàn)證奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

此次實(shí)驗(yàn)造模較成功，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重，進(jìn)食量及HDL-C、TC、LDL-C、TG 血液指標(biāo)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示特征表現(xiàn)。但仍存在一些缺陷待進(jìn)一步改進(jìn)，如實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)食量明顯低于對照組，可能的是自制高脂乳劑中丙硫氧嘧啶濃度過高，影響大鼠食欲有關(guān)，自制高脂乳劑濃度高，不易消化；通過灌喂自制高脂乳劑可使TC、HDL-C、LDL-C 水平升高，但TG 水平改變不明顯，可能與自制高脂乳劑中膽固醇、豬油的含量、灌喂高脂乳劑的時間有關(guān)。

因此灌喂自制高脂乳劑制備高膽固醇血癥大鼠模型的方法可行，但在制備高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥、低高密度脂蛋白血癥的方法上仍需進(jìn)一步探究［19］。