局部進展期直腸癌圍放療期外周血免疫功能指標的變化

陳若，沈琦，羅文廣，雕麗瓊，張紅雁

(安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院腫瘤放療科，合肥 230001)

直腸癌是我國常見的消化道腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發病率中居第3 位，死亡率居第4 位[1-2]。由于直腸癌解剖位置局限在狹窄的骨盆內，增加了手術時保證完整切緣陰性的難度，也在一定程度上導致治療后出現并發癥風險增大、局部復發率增高，特別是對于局部進展期直腸癌，預后不良的比率更高[3]?，F直腸癌的治療方式有手術治療、化學藥物治療、放射治療等，且直腸癌治療全程化的管理越來越趨向精細化、個性化。因此，如何利用多學科綜合治療的模式來提高直腸癌精準治療程度以及降低直腸癌的死亡率，成為目前直腸癌臨床研究中亟待解決的問題之一。

本研究通過流式細胞技術檢測直腸癌患者圍放療期外周血T 淋巴細胞、CD4+T 細胞、調節性T 細胞(Treg 細胞)、自然殺傷細胞(NK 細胞)、血小板與淋巴細胞比值(PLR)的變化情況。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇安徽省立醫院腫瘤放療科2018 年1 月到2019 年10 月共54 例接受放射治療的直腸癌患者，其中男性35 例，女性19 例；年齡范圍27～87 歲，平均年齡為55.96 歲；病理為高分化腺癌8 例，中分化腺癌33 例，低分化腺癌13 例；根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)制訂的第8 版TNM分期標準Ⅱ期14 例，Ⅲ期40 例。術前短程快速大分割放療9 例，術前常規分割放療17 例，術后常規分割放療28 例。本研究經安徽省立醫院醫學倫理委員會批準(倫理批件號：2019KY 倫審第101 號)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：病理為直腸腺癌的患者；(2)無嚴重心、肝、腎功能不全，無全身性嚴重疾?。?3)未同時接受免疫治療的患者；(4)MSS(microsatellite stable，微衛星穩定)基因檢測未檢測到MSI-H(microsatellite instability-high，高度微衛星不穩定)；(5)無其他腫瘤以及放療前CT、MRI 等各項影像學檢查提示未見遠處器官轉移；(6)按照術前(已行手術患者)或放療前(未行手術患者)定位掃描時MRI 分期，選擇TNM 分期為Ⅱ-Ⅲ期的患者；(7)自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：(1)有遠處轉移的患者；(2)曾合并其他惡性腫瘤的患者；(3)同時接受慢性系統性免疫治療的患者；(4)患者依從性差，不能配合完成本研究的信息采集。

1.3 治療方案

1.3.1 方案推薦 局部進展期直腸癌患者現推薦行“新輔助放化療+手術”或“手術+術后輔助放化療”，采用6Mv-X 線IMRT(intensity-modulated radiation therapy，適形調強放療)治療，給予全盆腔照射，劑量分割方式有兩種，25 Gy/5f/1 周和50 Gy/25f/5 周。

1.3.2 靶區勾畫 (1)術前靶區定義：GTVnd(lymph node gross tumor volume，陽性淋巴結大體腫瘤體積)包含直腸MRI/盆腔CT 顯示的直腸系膜區、骶前區、髂總、髂內、閉孔以及髂外大于1 cm 的轉移淋巴結和癌結節。CTVp(primary tumor CTV，原發腫瘤臨床靶區)特指原發灶的臨床靶區，包括原發灶頭腳方向外擴2 cm 的范圍。CTV(clinical target volume，臨床靶區)為包括高危淋巴結引流區，部分髂總、髂內、髂外(下界到股骨頭出現水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區以及腹股溝淋巴引流區(視患者具體情況確定是否包括)，PTV(plan target volume，計劃靶區)在CTVp 和CTV 基礎上前后左右外放0.5～0.7 cm。(2)術后靶區定義：包括瘤床、吻合口[經腹直腸癌切除術(Dixon 術)]、會陰瘢痕(腹會陰聯合直腸癌根治術(Miles 術)、術后高危淋巴結引流區及高危復發區，部分髂總、髂內、髂外(下界到股骨頭出現水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區以及腹股溝淋巴引流區，PTV 在CTV 基礎上前后左右外放0.5～0.7 cm。正常組織限量：膀胱V50＜50%，小腸V50＜10%、最大劑量小于52 Gy，股骨頭V50＜5%。

1.3.3 具體方案 本研究根據患者個體化情況，治療方案分為3 種：(1)術前短程大分割放療(放療后7～10 d 行手術)(2)術前常規分割放療同步化療(放療后4～6 周行手術)(3)術后常規分割放療同步化療(術后4 周至6 周行放療)。同步化療方案為卡培他濱(正大天晴藥業集團股份有限公司/上海羅氏制藥有限公司產)化療(卡培他濱劑量根據患者體表面積計算，用量為825 mg/m2，1 日2 次，每周第1 天至第5 天服用)。

1.4 檢測方法 于研究對象實施第1 次放療前1天、放療計劃結束后1 天及放療結束后1 月抽取患者靜脈血2 mL，采用流式細胞術檢測患者外周血T細胞亞群的占比，采用三激光10 色法，檢測患者血清T 淋巴細胞、CD4+T 細胞及NK 細胞占淋巴細胞百分比、Treg 細胞占CD4+T 細胞百分比。

1.5 統計學處理 應用SPSS 22.0 分析數據。主要數據為多時點觀測計量資料，以描述，組間比較為單因素重復測量方差分析+組內各時點間兩兩比較差值t 檢驗。 P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血免疫功能指標變化 患者外周血T 淋巴細胞、CD4+T 細胞、Treg 細胞及NK 細胞絕對值放療結束時較放療開始時下降，放療結束后1 月較放療結束時絕對值升高，差異均有統計學意義。PLR 放療結束時較放療前升高，放療結束后1 月較放療結束時下降，差異有統計學意義。見表1。

2.2 相關性分析 Treg 細胞與PLR 的表達水平呈負相關，相關系數為-0.453，差異有統計學意義(P ＜0.05)。NK 細胞與PLR 的表達水平呈負相關，相關系數為-0.545，差異有統計學意義(P ＜0.05)。T 淋巴細胞與PLR 的表達水平呈負相關，相關系數為-0.604，差異有統計學意義(P ＜0.05)。CD4+T細胞與PLR 的表達水平呈負相關，相關系數為-0.592，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.3 隨訪結果 截止至2020 年1 月，僅有4 例患者出現病情進展，各項指標與無進展組差異無統計學(P ＞0.05)。

3 討論

目前直腸癌個體化精準治療模式仍在不斷探索中，荷蘭的NICHE 研究[4]、checkmate 142 研究[5]等現在正在進行的研究都表明了免疫治療對于提高患者直腸癌的緩解率有較大作用。近年來，直腸癌治療領域除了放療、手術、化療和靶向治療[6]，已成為一個新的研究熱點。本研究選擇LARC 患者，采集患者放化療期間外周血，通過觀察、了解T 細胞亞群及NK 細胞等的變化，尋找免疫細胞在放射治療模式中的作用機制，并尋找新的能在直腸癌治療策略中評估預后、防止不良事件發生的特異性指標。

腫瘤微環境是一個復雜的系統[7]，T 淋巴細胞作為細胞免疫中重要的一環，在腫瘤的發生、發展中有著不可或缺的作用[8-9]。本研究中LARC 癌患者T 淋巴細胞絕對值、CD4+T 細胞絕對值于放療結束后到結束后1 月時免疫功能有一定回升的趨勢，一定程度證明了放射治療結束后患者免疫能力得到恢復。臨床上可通過T 淋巴細胞亞群的檢測來了解直腸癌患者機體免疫系統情況，為預后的預測以及治療方案選擇提供新思路。

在腫瘤微環境中，Treg 細胞占正常人外周血及脾臟組織中的CD4+T 細胞的5%～10%[10-11]。細胞缺乏或細胞功能障礙是惡性腫瘤患者自身免疫紊亂的原因[12-13]，因此，它們是設計誘導或消除自身和非自身抗原的免疫耐受的良好靶點。本研究結果表明LARC 患者外周血Treg 細胞絕對值放療結束時較放療前下降，放療結束后1 月較放療結束時升高，差異有統計學意義(P ＜0.05)。以上結果一定程度上提示放療結束后的一段時間，LARC 患者T淋巴細胞、CD4+T 細胞、Treg 細胞有增長趨勢，Treg細胞高浸潤對患者預后的改善有一定價值。Treg 細胞產生的外泌體可調控腫瘤細胞以及腫瘤的微環境，引起腫瘤免疫逃逸，影響腫瘤的形成、侵襲和轉移[14]，假設將Treg 細胞來源的外泌體作為治療的手段，放療后增高的Treg 細胞數目可以增加免疫治療的靶點，從而改善預后。

NK 細胞是一種大顆粒淋巴細胞，相對于T 細胞，其通過激活和抑制細胞表面受體的信號，誘發快速的抗腫瘤反應[15-16]。本研究中放療結束后1 月時NK 細胞較放療結束時明顯升高，一定程度上表明直腸癌患者治療后體內免疫系統被調動，為臨床提供了新思路：臨床上是否可應用治療方式增強其體內免疫系統活性以達到改善抗腫瘤反應的作用。

PLR 是綜合反映全身炎性反應和免疫系統功能的關鍵指標之一。有文獻通過檢測結直腸癌的腫瘤標志物以及炎性指標指出PLR 的升高提示直腸癌患者可能已經存在遠處器官轉移[17]，且比值升高與患者生存期呈負相關[18]。本研究中PLR 放療結束時較放療前、放療結束后1 月較放療前升高，差異有統計學意義(P ＜0.05)，放療結束后1 月較放療結束時下降，差異有統計學意義(P ＜0.05)。放療結束時較放療前比值升高，考慮可能為直腸癌患者同步放化療期間，出現的骨髓抑制對PLR 的升高產生一定程度上的影響。放射治療計劃結束后由于放療具有遠隔效應，從而使放療結束后比值成下降趨勢，提示放療影響了患者的免疫功能。本研究中對比LARC 患者治療前的T 細胞亞群絕對值和PLR 比值，兩者為負相關關系，說明在腫瘤微環境中，免疫和炎癥系統有著相互制衡的關系。

表1 接受放射治療的直腸癌患者放療前后免疫指標變化()

表1 接受放射治療的直腸癌患者放療前后免疫指標變化()

注：與放療前比較，aP ＜0.05；與放療結束時比較，bP ＜0.05

綜上所述，本研究發現局部進展期直腸癌放療前與放療結束時、放療前與放療結束后1 月免疫細胞變化一定程度上提示放療調動了細胞免疫，可以進一步改善患者的預后。PLR 圍放療期比值改變提示放療可能通過改善患者的免疫功能來延長患者的生存期。T 細胞亞群檢測聯合炎癥指標作為非侵入型手段，目的是篩選高獲益人群，提高治療的個體化以及精準化，預測療效性預后。