杞精明目湯聯合人工淚液對結膜松弛癥臨床療效及細胞衰老的影響

周歡明，項敏泓，麻 凱，文 杭，趙艷青，劉 江

0引言

結膜松弛癥(conjunctivochalasis，CCH)是老年人高發的眼表疾病[1]。隨著健康普及，中國的人口老齡化越來越嚴重，CCH患者日趨增多。針對老年人CCH發病率較高的特點，研究證實細胞衰老可能是CCH發病的關鍵[2-3]。CCH患者出現一系列眼表淚液學異常，包括流淚、異物感、干澀，嚴重者出現結膜下出血、角膜潰瘍影響生活[4]。自擬方劑杞精明目湯應用多年，取得一定的治療效果[5-6]，本研究擬進一步探討杞精明目湯聯合治療CCH的臨床效果及對細胞衰老的影響。

1對象和方法

1.1對象收集2017-01/2018-11在上海中醫藥大學附屬普陀醫院眼科確診為CCH的病例共40例80眼，按隨機數字表法分為兩組：聯合治療組(杞精明目湯聯合人工淚液)20例40眼，男9例，女11例；年齡71.63±4.76歲；按CCH診斷分級標準[7]：Ⅱ級18眼、Ⅲ級20眼、Ⅳ級2眼。人工淚液組20例40眼，男8例，女12例；年齡70.59±3.57歲；按CCH診斷分級標準[7]：Ⅱ級20眼、Ⅲ級19眼、Ⅳ級1眼。兩組性別、年齡、眼別、CCH級別等比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會的審查批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.1納入標準(1)符合CCH診斷標準且臨床分級為Ⅱ級及以上的患者[7]；(2)屬于中醫肝腎陰虛型的CCH[5]，癥候表現為眼內干澀不爽，白睛隱隱淡紅，雙目頻眨，羞明畏光，久視后則諸癥加重，伴口干少津，腰膝酸軟，頭暈耳鳴，夜寐多夢，舌紅，苔薄，脈細等諸癥；(3)觀察角膜、淚小點正常，淚道沖洗通暢。無淚囊炎及鼻淚管阻塞病變，無瞼內外翻及倒睫；(4)無眼部手術史或3mo內使用影響淚液分泌的藥物，無其他引起淚液學異常的全身性疾病；(5)自愿受試并簽署知情同意書。

1.1.2排除標準(1)有瞼內/外翻、倒睫、瞼緣炎、瞬目異常或淚液蒸發過強型干眼；(2)有青光眼或高眼壓病史；(3)有全身或眼部免疫性疾病患者，如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、干眼綜合征等；(4)妊娠或哺乳期婦女；(5)嚴重過敏體質者；(6)嚴重糖尿病、心腦血管疾病、肝腎功能異常者。

1.1.3材料與儀器

1.1.3.1藥物杞精明目湯為枸杞子15g、黃精20g、麥冬20g、茯苓10g、炙甘草3g、旱蓮草15g、川芎3g構成，由本院中藥房提供。人工淚液為3g/L玻璃酸鈉滴眼液。

1.1.3.2主要材料與儀器BQ 900裂隙燈(瑞士HAAG-STREIT公司)，熒光素鈉檢測試紙和淚液檢測濾紙條(天津晶明新技術開發有限公司)，β-半乳糖苷酶染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，OCT包埋液(日本櫻花公司)，全自動制冰機(江蘇格林電器有限公司)，O.C.T冰凍切片包埋機(日本Tissue-Tek公司)，倒置顯微鏡(德國Wilovert公司)。

1.2方法

1.2.1治療方法人工淚液組：3g/L玻璃酸鈉滴眼液常規點眼，每日3次，每次1滴，共使用3mo。聯合治療組：人工淚液局部點眼的基礎上聯合應用杞精明目湯口服治療。杞精明目湯水煎每日1劑，共服用3mo。中藥炮制方法采用冷水浸泡，中到大火煎煮，分2次煎，分早晚2次服用。

表1 兩組CCH治療前后OSDI評分比較分)

組別n治療前治療3mo后tP人工淚液組407.13±2.767.83±3.091.6510.107聯合治療組407.00±1.849.25±3.027.809<0.001 t0.2392.087P0.8120.040

1.2.2觀察指標對所有入選的CCH患者于治療前及治療3mo后隨訪。應用國際眼表面疾病指數(ocular surface disease index，OSDI)評估眼部癥狀，積分越高則表示眼表癥狀嚴重程度越高[8]。裂隙燈檢查松弛結膜狀況、淚膜破裂時間(tear break-up time，BUT)評估淚膜穩定性、基礎淚液分泌試驗(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)評估淚液分泌量。所有檢查均由同一人完成。

1.2.3手術方法對于臨床分級在Ⅲ級及以上、隨訪觀察3mo及以上、有手術意愿的兩組CCH患者，入院行松弛結膜新月形切除術。具體方法：開瞼器開瞼，手術顯微鏡下評估需切除的松弛結膜范圍，距角膜緣后5～6mm的下方球結膜按角膜緣弧度新月形切除松弛的結膜組織，10-0尼龍線縫合[9]。

1.2.4標本處理及細胞衰老染色切除的松弛結膜組織置于O.C.T.包埋液中，-80℃冰箱凍存。冰凍組織塊切片加入適量的β-gal細胞衰老染色工作液，常溫孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察并拍片記錄。

2結果

2.1 CCH治療前后OSDI評分兩組治療前OSDI差異無統計學意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后較治療前OSDI顯著下降，差異有統計學意義(t=20.910,P<0.001)。聯合治療組治療3mo后較治療前OSDI顯著下降(t=18.976,P<0.001)。治療3mo后OSDI評分聯合治療組要明顯優于人工淚液組(t=3.697,P<0.001)，見表1。

2.2 CCH治療前后BUT兩組治療前BUT差異無統計學意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后與治療前BUT差異無統計學意義(t=1.651,P=0.107)。聯合治療組治療3mo后BUT較治療前顯著延長(t=7.809,P<0.001)，且聯合治療組治療后的BUT顯著優于人工淚液組，差異有統計學意義(t=2.087,P=0.040)，見表2。

2.3 CCH患者治療前后SⅠt兩組治療前SⅠt差異無統計學意義(P>0.05)。人工淚液組治療3mo后與治療前的SⅠt比較，差異無統計學意義(t=0.971,P=0.338)。聯合治療組治療3mo后較治療前的SⅠt顯著增加(t=4.811,P<0.001)，且治療后的SⅠt聯合治療組顯著優于人工淚液組，差異有統計學意義(t=2.330,P=0.022)，見表3。

圖1 光鏡觀察細胞衰老染色，松弛結膜上皮細胞層染色各層清晰，β-gal染色衰老陽性細胞呈現藍色(箭頭標注)，主要分布在結膜上皮層下(β-gal×200) A：聯合治療組，結膜上皮層相對較厚，上皮層下散在分布衰老染色陽性細胞；B：人工淚液組，結膜上皮層變薄，組織連接疏松，衰老染色陽性細胞較多。

組別n治療前治療3mo后tP人工淚液組407.03±3.307.28±2.810.9710.338聯合治療組407.40±3.368.95±3.574.811<0.001 t0.5042.330P0.6160.022

2.4 CCH患者細胞衰老染色治療3mo后采取結膜新月形切除術治療的CCH患者共11例11眼，其中人工淚液組7例7眼(18%)，年齡72.50±3.09歲；聯合治療組4例4眼(10%)，年齡71.07±2.27歲；兩組性別、年齡、眼別及CCH級別差異均無統計學意義(P>0.05)，可見人工淚液組的手術率明顯高于聯合治療組。對手術切除的松弛結膜組織行細胞衰老染色，發現兩組CCH患者松弛結膜組織中均出現β-gal細胞衰老染色陽性細胞，且主要分布于結膜上皮層下。其中人工淚液組衰老陽性細胞計數為39.00±14.09個，顯著高于聯合治療組16.00±7.84個，差異有統計學意義(t=3.190，P=0.013，圖1)。

3討論

眼科醫師在日常工作中經常會面對CCH患者，該病是門診常見但易誤診的眼表疾病之一。其診斷難點在于癥狀非特異性，起病隱蔽性[10]。輕中度患者癥狀輕微，可通過熱敷、按摩、理療和人工淚液治療。但嚴重病例保守治療無效，常采用手術。手術方法包括新月形松弛結膜切除術[9]、結膜鞏膜縫線固定術[11]及電凝治療術[12]等。但手術風險大且有一定適應證，切除松弛結膜過少癥狀沒有改善，易復發；而切除過多可致結膜囊縮窄，甚至影響眼球轉動。結膜鞏膜縫線固定術還可能穿破鞏膜壁，損傷脈絡膜、視網膜的風險。所以國內外學者都在尋求一種安全、有效的治療手段[13]。

CCH的發病機制目前尚不清楚，可能涉及不同的因素，如結膜老化、淚膜不穩定、機械摩擦、眼表炎癥和淚液清除延遲[14]。近期研究通過基因測序和分子生物學技術發現CCH與細胞衰老相關,且衰老相關因子p53/p21表達上調[2-3]。中醫經典《銀海指南》中“白睛起膜，狀若魚泡，寒郁太陰也”與CCH所述癥狀與體征一致，表現為松弛的結膜堆積于瞼緣，導致眼表微環境失衡，淚液分泌和排泄異常，出現眼部異物感、淚溢、癢、澀、灼痛等，其屬于“白澀癥”“干澀昏花癥”“神水將枯”范疇。《諸病源侯論》述“目澀癥”的病機為“目，肝之外侯也…其液竭者，則目澀”，《素問·逆調論》曰“腎者水臟，主津液”。當肝腎不足則目外少潤澤之水，內缺充養之液，雙目澀滯導致CCH。肝腎陰虛貫穿了CCH的發生發展過程，并影響本病的預后及轉歸[5]。

結合CCH的中醫癥候和肝腎陰虛的特點，自擬中藥方劑杞精明目湯在臨床上取得了較好的治療效果[5-6]。方劑中枸杞子滋補肝腎、益精明目，提高機體免疫力、抗衰老、抗氧化，對肝陰虛、腎陰虛均有一定療效[15]；黃精滋陰潤肺、健脾益腎，可延緩衰老[16]；麥冬養陰潤肺，益胃生津，增強免疫功能及抗炎活性[17]；三者同為君藥。茯苓利水滲濕、可延緩衰老，增強免疫功能；炙甘草補脾益氣、調和諸藥，以助生化，兩者共為臣藥。旱蓮草滋補肝腎，對于肝腎陰虛體質人群可增強機體免疫力、消除氧自由基和抗炎為佐藥。川芎活血化瘀、載藥上行為使藥，改善微循環、延緩腎臟病損[18]。縱觀全方補肝益腎、益氣養陰，兼具抗衰老、抗氧化之功效。本研究證實杞精明目湯聯合人工淚液治療組和人工淚液組均可降低CCH患者的OSDI評分(P<0.01)，緩解眼表不適癥狀，但杞精明目湯聯合治療要明顯優于單純人工淚液治療(t=3.697,P<0.001)。聯合治療還可顯著延長CCH的淚膜破裂時間(t=7.809,P<0.001)，明顯改善淚液分泌(t=4.811,P<0.001)，而單純人工淚液點眼不能穩定淚膜及改善淚液分泌(均P>0.05)。

細胞受到某些特定的刺激后，細胞的應答程序被激活的現象被稱為細胞衰老。衰老的細胞通常會在形態學上發生特異性的變化，而β-gal則是目前為止能夠鑒別細胞衰老特異性最強的標志[19]。因此在前期研究的基礎上[2-3]，本研究對CCH手術切除的松弛結膜組織行β-gal細胞衰老染色，發現兩組CCH松弛結膜組織上皮層下均出現衰老相關β-gal染色陽性細胞，其中單純人工淚液組的細胞衰老染色陽性細胞計數明顯高于杞精明目湯聯合人工淚液治療組(t=3.190，P=0.013)，再次證實CCH中確實存在細胞衰老，而杞精明目湯從一定程度上可延緩衰老，從而發揮治療作用。通過聯合應用中藥杞精明目湯治療后，CCH患者癥狀、體征均明顯改善，因此需要手術的患者減少，從而避免了手術帶來的風險，可以作為一種安全、有效的替代治療方案，但是還需要長期的隨訪觀察。

關于杞精明目湯延緩細胞衰老的分子機制，既往研究發現杞精明目湯含藥血清可下調CCH成纖維細胞中MAPK信號通路相關蛋白和基因的表達，尤其是抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化水平和基因表達[20]。已知p38 MAPK信號通路是MAPK家族中的重要組成部分，調控細胞周期、細胞增殖、衰老和凋亡；p38 MAPK可上調衰老相關因子p53/p21的表達，介導CCH成纖維細胞的衰老過程[2]。同時CCH中的熱休克蛋白、滲透壓改變、白介素1和腫瘤壞死因子α等細胞因子激活p38 MAPK信號通路，誘導氧化應激[21]；氧化應激損傷又反過來激活p38 MAPK信號通路，加速其下游衰老相關因子的表達，不斷惡性循環最終導致細胞衰老[22]。而杞精明目湯中含有多味抗衰老的中藥成分，本方主要成分之一枸杞的提取物可明顯緩解鼠模型的干眼癥狀[23]；枸杞中主要成分枸杞多糖可以降低p53、p21、Bax等衰老基因的表達，同時增加端粒酶逆轉錄酶活性[24]。黃精亦可增強端粒酶活性、對抗自由基損傷，增強免疫能力來延緩衰老[25]。推測杞精明目湯可能通過抑制p38 MAPK/p53/p21信號通路，延緩CCH細胞衰老從而發揮治療作用，其具體機制尚需實驗進一步證實。

綜上，杞精明目湯聯合人工淚液治療CCH可顯著改善臨床癥狀，維護淚膜穩定性，改善淚液分泌及減少細胞衰老的產生，其療效較之單純人工淚液治療更為有效，可作為除手術治療之外的安全、有效的替代治療方案。