沉水植物綠羽毛狐尾藻組織培養體系的建立

邢春玉 張秋

摘要 以小二仙草科觀賞沉水植物綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）莖段為外植體，比較升汞、次氯酸鈉在不同濃度、不同處理時間下對外植體滅菌效果的影響;以MS為基本培養基，研究不同質量濃度配比的6-BA和NAA對芽誘導和生根培養的影響。結果表明，外植體最佳消毒方式為70%乙醇（20 s）+無菌水沖洗4次+0.1%升汞（結合吐溫80），消毒5 ?min;最適合芽誘導的培養基為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，誘導率為89.2%;最適合根誘導的培養基為MS+0.30 mg/L NAA，生根率達100%。

關鍵詞 綠羽毛狐尾藻;沉水植物;組織培養;再生體系

中圖分類號 S682.32 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）10-0068-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.019

Abstract The stem segments of ornamental submerged plant Myriophyllum hippuroides were used as explants，with different concentrations of mercuric chloride and sodium hypochlorite in different processing time on explants，and the sterilization effects were compared by different disinfection methods.The effects of different ratio concentration of 6BA and NAA on adventitious bud induction and rooting culture were studied with stem segment as explants and MS as media.The results showed that the optimal way to sterilization for explants was 70% ethyl alcohol（20 s）+sterile water washing 4 times+0.1% HgCl2（with Tween80）for 5 min.The most suitable medium for bud induction was MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，the inducation rate reach 89.2%;the most suitable medium for root induction was MS+0.30 mg/L NAA，the rooting rate could reach 100%.

Key words Myriophyllum hippuroides;Submerged plant;Tissue culture;Regeneration system

沉水植物作為淡水生態系統的重要成員，在維持水生態系統結構和功能的穩定以及園林造景方面發揮重要作用。近年來，由于水體污染嚴重，導致河流沉水植物群落退化或消失，造成淡水生態系統的功能喪失[1]。沉水植物可防治水體富營養化，具有很好的脫氮除磷效果[2]，是水生植物群落重建與恢復的基礎和關鍵，因此沉水植物的引種成為水生植被恢復工程的首要環節。沉水植物主要以無性繁殖為主[3]，短時間內從異地采集種苗會遇到種源不足和采集地生態環境破壞等問題，而利用組織培養快繁技術可以解決這一問題。綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）為小二仙草科狐尾藻屬多年生沉水植物，原產美洲，為水族造景常用植物，具有較高的觀賞價值和一定水體凈化能力。因此，綠羽毛狐尾藻組織培養體系的建立，為沉水植物組織培養技術研究提供參考，對營建人工濕地景觀和水生植被恢復重建具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）購于水族市場，以長勢良好的幼嫩莖段作為外植體。

1.2 培養條件

試驗以MS培養基為基本培養基（含蔗糖20 g/L、瓊脂6 ?g/L，pH 5.8），分別添加不同濃度配比的6-BA和NAA，并于121 ℃高壓滅菌20 min。培養溫度為（24±1）℃，光強2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體的處理。

取長勢良好的綠羽毛草幼嫩植株，用洗衣粉浸泡20 min，自來水沖洗植株1 h，剪去葉片，用蒸餾水沖洗4遍。

1.3.2 外植體不同消毒方法的篩選。

將已經處理好的外植體置于超凈工作臺，采用不同消毒方式進行處理，初步清洗后的外植體采用70%乙醇表面消毒20 s，無菌水沖洗4遍，再分別用0.1%升汞或次氯酸鈉消毒（0.1%升汞結合吐溫-80，處理時間分別為3、5、7 min;1%次氯酸鈉，處理時間分別為3、5、7 min;2%次氯酸鈉，處理時間分別為3、5、7 min），不同處理見表1。消毒處理后用無菌水沖洗4遍，用無菌濾紙吸干多余水分，切取2 cm左右帶節莖段，接種到培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 ?mg/L NAA。每個處理接種30個外植體，重復3次。培養15 d后，統計污染率=污染外植體數/接種的外植體總數×100%，死亡率=死亡的外植體數/接種的外植體總數×100%，存活率=存活的外植體數/接種的外植體總數×100%。

1.3.3 芽誘導培養基的篩選。

選取已經滅菌完成的外植體，切取2 cm左右帶節莖段，接種到芽誘導培養基上。培養基為MS+蔗糖20 g/L+瓊脂6 ?g/L，pH 5.8，并添加0.25～2.00 ?mg/L 的6-BA及0.10～0.20 mg/L的NAA，以無激素培養基為對照，共設置9個處理，每個處理接入30個莖段，每個處理重復3次。置于培養室中培養，培養28 d后，統計不定芽數量和芽長，計算芽誘導率，誘導率=誘導出芽的外植體數/接種的外植體數×100%。

1.3.4 生根培養基的篩選。

為了研究不同濃度激素對根誘導的影響，將芽誘導培養基中長勢良好的芽苗在無菌條件下轉入生根培養基（MS+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L+NAA，NAA含量為0.10～0.30 mg/L）。每個處理接入20棵芽苗，設置3個重復，21 d后統計生根情況，根誘導率=誘導生根的芽苗數/接種的芽苗數×100%。

1.4 數據分析 試驗數據均表示為平均值±標準差，采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進行處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體滅菌效果的影響

消毒劑的濃度和處理時間不同，外植體的滅菌效果不同，不同消毒處理間存在較顯著差異（P<0.05）。從表1可以看出，在9種消毒處理中，0.1% 升汞結合吐溫-80處理5 min，污染率較低，為11.82%，外植體死亡率為21.11%，存活率可達67.07%，吐溫作為表面活性劑，可以使升汞與外植體表面充分接觸，消毒效果較好;當處理時間達到7 min時，外植體無法存活，死亡率較高。次氯酸鈉消毒處理總體上比0.1%升汞效果要差，隨著次氯酸鈉濃度增加、處理時間延長，污染率降低，但外植體存活率下降明顯，試驗中發現用2%次氯酸鈉處理7 min，外植體褐化嚴重，導致死亡。研究表明消毒劑處理時間短，滅菌不徹底，處理時間長則會破壞植物組織，導致外植體死亡，綜合考慮污染率和存活率，最佳滅菌方式為0.1%升汞結合吐溫-80，處理5 min。

2.2 不同激素濃度配比對芽誘導培養效果的比較

從表2可看出，6-BA和NAA不同濃度組合使芽數增加顯著高于對照組（P<0.05）。當6-BA和NAA濃度較低且濃度配比值低時，可在莖段莖節處長出側芽。培養基中添加0.25 ?mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時，芽苗生長較快，但較細弱（圖1A）。當添加0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時，芽誘導率最高，可達89.20%，芽苗呈深綠色，長勢良好（圖1B）。當添加0.50 mg/L 6-BA+0.05 ?mg/L NAA時，生長調節物質濃度較低，此時在莖段基部形成愈傷組織，從愈傷組織上長出芽苗，芽苗較短（圖1C）。隨著生長調節物質濃度增加，在莖段基部形成愈傷組織，長出的芽苗又會分蘗出側芽，芽苗長勢良好（圖1D）。

2.3 不同激素對根誘導培養效果的比較 將誘導生成的芽苗轉接到生根培養基上，在MS基本培養基中只添加NAA，芽苗生長情況見表3。接種7 d時有芽苗開始生根，21 d時0.30 mg/L NAA的培養基生根率達到100%，平均根長為7.59 cm（圖2A）。MS培養基中添加0.10 mg/L NAA時生根緩慢，培養21 d時根誘導率僅為66.67%，可見生長素的含量對根的形成有較大影響。

3 討論與結論

沉水植物為了適應水體生態環境而發生組織結構改變，表皮細胞壁薄，無角質層或角質層很薄，使得消毒劑通透性增強[4]，在滅菌的同時，對植物組織傷害較大，滅菌條件較難控制，因此，常用于陸生植物的消毒方法對沉水植物并不適用。升汞殺菌的原理是Hg2+可與帶負電荷的蛋白質結合，使蛋白質變性，酶失去活性;而次氯酸鈉的殺菌作用主要是次氯酸的氧化作用，不僅可與細胞壁發生作用，還可浸入細胞內與蛋白質發生氧化作用，使細胞糖代謝失調而死亡[5]，吐溫作為表面活性劑，可以使滅菌更加徹底，外植體染菌率低，成活率高，在對紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca）[6]和衛矛（Euonymus alatus）[7]外植體消毒過程中吐溫和升汞的結合為外植體消毒的最佳方法，與該試驗的結果相似。

植物組織培養中，不定芽誘導常用的激素為6-BA和NAA[8]，該研究發現激素濃度低且6-BA與NAA質量濃度比小于10∶1時，外植體莖節處長芽，由于激素含量低，芽苗較為細弱;當激素濃度升高且6-BA與NAA質量濃度比值超過10∶1時，莖段基部會形成愈傷組織，愈傷組織進一步分化形成芽苗，可見芽苗誘導效果既受到6-BA和NAA的濃度影響，同時還受到2種激素濃度比值的影響。從愈傷組織誘導途徑獲得植株個體，存在變異，不利于母本的特性保留[9]，綜合考慮得出該研究最適合芽誘導的培養基為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，誘導率達89.20%。

誘導芽苗生根時加入的NAA對根誘導具有促進作用[10]，隨著NAA濃度的增加，芽苗的生根率及生長速度都有顯著增加，該研究最適合的根誘導培養基為MS+0.30 mg/L NAA，培養21 d的生根率高達100%，平均生根數為4.5條。

該試驗從外植體滅菌、芽誘導培養基、根誘導培養基的篩選3個方面研究了沉水觀賞植物綠羽毛狐尾藻的組織培養離體快繁技術，此技術能夠短期內培育出大量種苗，可用于水體環境修復，因其為水族造景常用植物，其經濟意義不言而喻。

參考文獻

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