翡翠貽貝降血壓肽酶解制備工藝研究

安婷婷 陳麗美 鄧長春

摘要 [目的]研究翡翠貽貝蛋白酶解的工藝條件，為后期開發(fā)保健食品和藥品提供基礎(chǔ)。[方法]以ACE抑制率為指標(biāo)，在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗研究溫度、pH、料液比和酶與底物的質(zhì)量比確定酶解工藝。最后以ACE抑制率和水解率2個指標(biāo)研究酶解時間。[結(jié)果]最佳酶解工藝為：堿性蛋白酶，酶解溫度為50 ℃，酶解pH為9.5，料液比為1∶4（g∶mL），酶與底物質(zhì)量比為1%，酶解時間為2 h。[結(jié)論]堿性蛋白酶可以酶解翡翠貽貝得到翡翠貽貝降血壓肽，此酶解方法簡單、可行。

關(guān)鍵詞 翡翠貽貝;降血壓肽;酶解工藝;正交試驗

中圖分類號 R282.77 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）10-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.037

Abstract [Objective]To study the conditions of enzymatic hydrolysis of Perna viridis， which provided a basis for the later development of medicine and health food.[Method]The temperature， pH， solidliquid ratio，mass ratio of enzyme to substrate on enzymatic hydrolysis process was studied to obtain enzymolysis technology by orthogonal experiment on the basis of single factor experiment.Finally， the time of enzymatic hydrolysis was studied by monitoring the ACE inhibition rate and hydrolysis rate.[Result]The optimal enzymatic conditions of alkaline proteade were the temperature 50 ℃， pH 9.5， solidliquid ratio 1∶4（g∶mL），mass ratio of enzyme to substrate 1%，emzymolysis time was 2 h.[Conclusion]The alkaline protease can hydrolyze Perna viridis to obtain the antihypertensive peptide of Perna viridis. This method is simple and feasible.

Key words Perna viridis;Antihypertensive peptide;Enzymolysis technology;Orthogonal experiment

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血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（angiotensin converting enzyme inhibitory peptides）是一種對 ACE 活性具有抑制作用的多肽類物質(zhì)，一般由 2～20 個氨基酸殘基組成，一般是由蛋白質(zhì)酶解而得，其通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成以及抑制血管舒緩激肽的分解而達(dá)到降血壓的作用[1-3]。由于蛋白酶的酶切位點(diǎn)不固定，酶切后得到的多肽也是多種多樣的。翡翠貽貝（Perna viridis（Linnaeus）），又名綠殼菜蛤、淡菜或青口螺，廣泛分布于東海南部和南海，容易人工養(yǎng)殖，繁殖能力很強(qiáng)，產(chǎn)量高，含有豐富的蛋白質(zhì)、?；撬岬萚4]，其中粗蛋白含量占鮮肉重的9.27%、干肉重的52.31%[5]。該研究以去殼的翡翠貽貝為原料，以水解度和ACE抑制率為指標(biāo)，其中，高效液相法評價ACE[6]抑制率，pH-stat法[7]測定水解度。首先通過比較4種蛋白酶對翡翠貽貝的酶解效果，確定最佳用酶，然后通過單因素試驗，設(shè)計優(yōu)化出堿性蛋白酶水解翡翠貽貝制備ACE抑制肽的最佳反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

中性蛋白酶（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）;堿性蛋白酶（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）;胃蛋白酶（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;胰蛋白酶（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）;馬尿酸（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）;硼砂（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）;硼酸（廣州化學(xué)試劑廠）;TFA（三氟乙酸，廣州化學(xué)試劑廠）;無水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠）;氫氧化鈉滴定液（深圳市博林達(dá)科技有限公司）;氫氧化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）;氯化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）;乙酸乙酯（西隴科學(xué)股份有限公司）;鹽酸（廣州化學(xué)試劑廠）;乙腈（TEDIA）;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE，上海源葉生物科技有限公司）;翡翠貽貝（瓊海采集）;馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL，SIGMA）。

1.2 試驗儀器

電子天平（BP211D，Sartorius）;電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司）;循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-95，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;超聲波清洗器（SK250HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16MC，長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司）;高效液相色譜儀（LC-2010AHT，島津企業(yè)管理（中國）有限公司）;C18柱（YMC）;真空干燥箱（DZF-6050，山海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;雷磁實(shí)驗pH計（PHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;恒溫磁力攪拌器（85-2，常州澳華儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 翡翠貽貝粗蛋白的制備。

新鮮翡翠貽貝清潔后去殼及足絲，留肉并切碎，勻漿，冷凍干燥，以1∶4（m/V）比例加入95%乙醇，50 ℃脫脂4 h，重復(fù)4次，真空干燥后，粉碎，得翡翠貽貝粗蛋白粉，置-20 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 ACE抑制率測定方法。

分別取表1所示體積的HCl、HHL、ACE抑制劑、硼酸鹽緩沖液和ACE于同一離心管中，37 ℃下水浴反應(yīng)35 min，后加入150 μL的1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，過濾，即得樣品溶液、對照溶液和空白溶液。

取上述樣品溶液、對照溶液和空白溶液各20 μL，HPLC測定馬尿酸峰面積。色譜條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：0.1%TFA乙腈∶0.1%TFA水，流動相時間程序如表2所示。檢測波長228 nm[8];流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

根據(jù)馬尿酸峰面積計算翡翠貽貝酶解液的ACE抑制率：ACE抑制率=（A1-A2）/A1×100%，其中，A1為不加翡翠貽貝酶解液時馬尿酸的峰面積，A2為加入翡翠貽貝酶解液時馬尿酸的峰面積。

1.3.3 酶解工藝的研究。

1.3.3.1 酶的種類對ACE抑制率的影響。

稱取翡翠貽貝粗蛋白5 g，溶于25 mL超純水（料液比為1∶5），混合均勻，分別加入表3中4種酶0.1 g（酶與底物的質(zhì)量比2%），按照表3所示酶解條件，0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，并按照最適溫度在恒溫水浴鍋中水浴2 h，酶解后，放入95 ℃水浴中10 min終止酶解反應(yīng)，離心（4 000 r/min）15 min，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率測定馬尿酸峰面積，并計算ACE抑制率。

1.3.3.2 pH對ACE抑制率的影響。

以ACE抑制率為指標(biāo)，料液比為1∶5，堿性蛋白酶與底物質(zhì)量比為2%，溫度為50 ℃條件下酶解時間4 h，用0.5 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH為8.5、9.0、9.5、10.0、10.5酶解，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率。

1.3.3.3 溫度對ACE抑制率的影響。

以ACE抑制率為指標(biāo)，料液比為1∶5，堿性蛋白酶與底物質(zhì)量比為2%，pH為9.5條件下酶解時間4 h，分別在45、47、50、52、54 ℃條件下酶解，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率。

1.3.3.4 料液比對ACE抑制率的影響。

以ACE抑制率為指標(biāo)，堿性蛋白酶與底物質(zhì)量比為2%，pH為9.5，溫度50 ℃條件下酶解時間4 h，分別在料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7條件下酶解，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率。

1.3.3.5 酶與底物的質(zhì)量比對ACE抑制率的影響。

以ACE抑制率為指標(biāo)，料液比為1∶5，pH為9.5，溫度50 ℃條件下酶解時間4 h，分別在堿性蛋白酶與底物質(zhì)量比為1%、2%、3%、4%、5%條件下酶解，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率。

1.3.3.6 翡翠貽貝ACE抑制肽酶解工藝條件優(yōu)化。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酶解溫度、酶解pH、料液比、底物與酶質(zhì)量比為考察因素，通過表4中L9（34）正交試驗對酶解工藝設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3.7 水解時間對ACE抑制率的影響。

在料液比為1∶5，堿性蛋白酶與底物質(zhì)量比為1%，pH為9.5，溫度50 ℃條件下酶解時間4 h，酶解時用0.2 mol/L NaOH滴定維持pH恒定9.5，分別記錄0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00 h的NaOH滴定量，取上清液，分別按“1.3.2”方法測定ACE抑制率。

同時計算每一個時間段翡翠貽貝粗蛋白的水解度，水解度的計算公式如下：

DH=B×NbMP×1α×1htot×100%

其中，B為NaOH的滴定量;Nb為滴定所用的NaOH的濃度;MP為底物中蛋白質(zhì)的總量;htot為每1 g原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，在該作用條件下取7.77 mmol/g;α取0.44。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類對ACE抑制率的影響

按“1.3.3.1”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖1所示。酶的種類不同，其底物特異性及作用位點(diǎn)也不同，不同的酶對于同一種蛋白質(zhì)酶解得到產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能也不同。目前研究表明，肽鏈C末端是脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸或者序列中含有疏水性氨基酸是維持高ACE抑制活性所必需[1，9]。堿性蛋白酶對疏水性氨基酸-COOH具有底物特異性[10]，此試驗堿性蛋白酶的活性最高，達(dá)100%。因此，該試驗的4種酶中選擇堿性蛋白酶為最佳用酶。

2.2 pH對ACE抑制率的影響?

按“1.3.3.2”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖2所示。在pH為8.5～9.5時，ACE抑制率隨著pH的增大而增加，ACE抑制率高達(dá)85.16%;而在9.5～10.5時，ACE抑制率反而隨著pH的增加而減小，即堿性蛋白酶的活性與所處環(huán)境pH有關(guān)，越接近最適pH，酶的活性越強(qiáng)，當(dāng)pH超過最適pH時，堿性蛋白酶逐漸失活。因此，確定此試驗的最適pH為9.5。

2.3 溫度對ACE抑制率的影響 按“1.3.3.3”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖3所示。在45～50 ℃時，酶活性隨著溫度的升高，ACE抑制率增大，在50 ℃時活性最強(qiáng)，而超過50 ℃溫度繼續(xù)升高，酶活性反而降低。溫度對酶活性的影響至關(guān)重要，在最適溫度前，酶活性隨著溫度的升高而增大，而后隨著溫度的升高，酶逐漸失活，ACE抑制率降低。所以，該試驗的最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.4 料液比對ACE抑制率的影響?

按“1.3.3.4”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖4所示。隨著料液比的增加，ACE抑制率明顯增加，當(dāng)料液比為1∶5時，ACE抑制率達(dá)到最大值，為83.3%，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時，抑制率反而略微降低，推測為底物濃度過大時，影響了堿性蛋白酶和蛋白質(zhì)分子的自由擴(kuò)散，不利于酶解反應(yīng)。因此，該試驗的最適料液比為1∶5。

2.5 酶與底物的質(zhì)量比對ACE抑制率的影響?

按“1.3.3.5”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)?shù)孜锖兔纲|(zhì)量比為3%時，ACE抑制率達(dá)到最大，為82.4%，后再增加酶用量，ACE抑制率的變化不大，原因可能為酶用量增加到一定程度，酶和蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。當(dāng)?shù)孜锖兔纲|(zhì)量比為2%，ACE抑制率為82.2%，考慮到酶的價格，故該試驗確定最佳底物和酶質(zhì)量比為2%。

2.6 翡翠貽貝ACE抑制肽酶解工藝條件優(yōu)化?

由表5中極差R分析得出，4個因素對酶解產(chǎn)物的ACE抑制率影響從大到小依次為pH、溫度、酶與底物的質(zhì)量比、料液比，其中，pH為主要影響因素。最佳酶條件組合為A2B2C1D1，即酶解pH為9.5，酶解溫度為50 ℃，料液比為1∶4，酶與底物的質(zhì)量比為1%。

2.7 水解時間對ACE抑制率的影響

按“1.3.3.7”所述進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖6所示。酶解時間在2 h內(nèi)，水解率和ACE抑制率均隨著而增加，當(dāng)超過2 h時，兩者只是略微變化，因為在酶解過程中，翡翠貽貝蛋白質(zhì)和堿性蛋白酶不斷消耗減少，底物生成增加，都不利于酶解反應(yīng)。故確定最佳酶解時間為2 h。

3 結(jié)論

該研究分別用4種蛋白酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶）酶解翡翠貽貝中的蛋白質(zhì)制備翡翠貽貝降血壓肽，以酶解液的ACE抑制率為指標(biāo)，選出最佳用酶，通過單因素試驗、正交試驗研究選出最佳酶解工藝，結(jié)果表明，最佳酶解工藝為堿性蛋白酶、料液比為1∶4、酶與底物質(zhì)量比1%、酶解pH 9.5、酶解溫度為50 ℃、酶解時間2 h，此時，ACE抑制率84.34%，水解率為24.67%。此酶解方法簡單、可行，可以作為酶解翡翠貽貝的酶解方法，得到高活性的ACE酶抑制劑。

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