長鏈非編碼RNA LOC554202作為內源競爭RNA調控微小RNA-98-5p在卵巢癌順鉑化療敏感性中的作用

魯笑欽，王志紅，付美洲，王 琪，王利君，李元昆

(1.鄭州大學第二附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫院教育培訓部，河南 鄭州 450003)

卵巢癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌，在女性生殖系統惡性腫瘤中居第2位，但病死率居首位[1-2]。手術聯合化療是卵巢癌患者的主要治療方式，化療耐藥是導致復發的重要因素。順鉑(DDP)在卵巢癌化療方案中極其重要，引起卵巢癌DDP耐藥的原因尚未完全明確。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)通過作為內源競爭RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)在卵巢癌DDP耐藥中起重要作用。本研究將對lncRNA LOC554202作為ceRNA調控微小RNA(micro RNA,miR)-98-5p在卵巢癌DDP耐藥中的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人卵巢癌細胞系A2780、人胚胎腎細胞系293T(美國ATCC細胞庫)，注射用DDP(山東齊魯制藥有限公司)，RNA提取Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR Green 1熒光染料試劑盒(日本TaKaRa 公司)，雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)，引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)，慢病毒包裝試劑盒、LipofectamineTM 3000試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，細胞計數試劑盒(CCK-8，日本同仁化學研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙熒光素酶檢測實驗 利用在線靶基因預測工具TargetScan (http://www.targetscan.org/)預測LOC554202與miR-98-5p存在的結合位點。利用雙熒光素酶檢測實驗驗證兩者的靶向關系。LOC554202序列片段(LOC554202-WT、LOC554202-MUT)構建熒光素酶報告基因載體pGL4.17。采用lipofectamineTM 3000 將LOC554202-WT或LOC554202-MUT與miR-98-5p-NC或miR-98-5p mimics共轉染293T細胞，按雙熒光素酶檢測實驗試劑盒說明書操作，檢測熒光素酶的熒光活性。

1.2.2 過表達和敲降LOC554202 利用對數生長期的A2780細胞株和DDP耐藥的A2780(A2780/DDP)細胞株，未轉染組細胞常規培養，其余分別轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOC554202，定量PCR(quantitative PCR，qPCR)檢測細胞中miR-98-5p的表達。利用對數生長期的A2780細胞株和A2780/DDP細胞株，未轉染組細胞常規培養，其余分別轉染siRNA-NC和siRNA-LOC554202，qPCR檢測細胞中miR-98-5p的表達。

1.2.3 qPCR實驗 Trizol抽提總RNA。逆轉錄合成互補DNA(complementary DNA，cDNA)：20 μL反應體系。反應條件：42 ℃，1 h；95 ℃，滅活10 min；冰浴5 min；cDNA保存于-20 ℃備用。根據從GenBank中查得的基因序列用Primer Design 軟件設計引物序列如下：LOC554202，F：5’-TCTCTGGTGCTTCCCTCCTT-3’，R：5’-GATCTAAGCTTGAGCCCCCA-3’；miR-98-5p，F:5’-CACCGCAGAAGCGGCACTTTATAAGCGAACT-3’，R:5’-TTATAAAGTGCCGCTTCTGCTTATAAGTTCGC-3’; U6，F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R:5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；β-actin，F：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，R：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。擴增條件：25 μL反應體系，94 ℃，2 min，預變性；94 ℃，30 s，變性；58 ℃，30 s，復性；72 ℃，40 s，延伸；共進行40個循環。設定每個循環退火期結束后程序自動記錄該循環的熒光值。qPCR實驗均重復3次。

1.2.4 CCK-8實驗 制備細胞懸液，細胞計數，96孔板中接種細胞后，置于37 ℃培養箱中。每孔加入10 μL CCK8溶液。將培養板在培養箱內繼續孵育2 h，用酶標儀測定波長450 nm處的光密度值(OD450)。CCK-8實驗均重復3次。

2 結果

2.1 雙熒光素酶檢測實驗驗證LOC554202和miR-98-5p的靶向關系生物信息學預測LOC554202和miR-98-5p存在靶向結合位點(圖1)。LOC554202-wt +miR-NC mimic組、LOC554202-WT +miR-98-5p mimic組、LOC554202-MUT +miR-NC mimic組、LOC554202-MUT +miR-98-5p mimic組熒光活素酶活性值分別為2.608±0.287、1.884±0.067、3.152±0.260、3.051±0.166，總體比較差異有統計學意義(F=23.365，P<0.001)。兩兩比較示，LOC554202-WT +miR-nc mimic組和LOC554202-WT +miR-98-5p mimic組比較差異有統計學意義(P<0.05)。這提示過表達miR-98-5p后，LOC554202熒光素酶活性顯著下調；LOC554202突變后熒光素酶活性下調作用消失，證實了miR-98-5p與LOC554202存在相互作用。

圖1 生物信息學分析預測 LOC554202和miR-98-5p靶向結合位點

2.2 LOC554202和miR-98-5p在A2780細胞株和A2780/DDP細胞株中的表達LOC554202在A2780/DDP細胞株中的相對表達量為0.509±0.032，低于A2780細胞株的1.001±0.054，比較差異有統計學意義(t=13.505，P<0.001)。miR-98-5p在A2780/DDP細胞株中相對表達量為2.184±0.076，高于A2780細胞株的1.001±0.048，比較差異有統計學意義(t=22.720，P<0.001)。見圖2、3。

圖2 LOC554202在不同細胞株中的表達

A2780細胞株和A2780/DDP細胞株比較，t=13.505，P<0.001

圖3 miR-98-5p在不同細胞株中的表達

A2780細胞株和A2780/DDP細胞株比較，t=22.720，P<0.001

2.3 過表達或敲降LOC554202對A2780細胞株miR-98-5p表達的影響pcDNA3.1-LOC554202組A2780細胞株LOC554202相對表達量為1.902±0.060，高于pcDNA3.1組的1.001±0.051，比較差異有統計學意義(t=19.874，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202組A2780細胞株miR-98-5p相對表達量為0.635±0.033，低于pcDNA3.1組的1.001±0.064，比較差異有統計學意義(t=8.863，P=0.001)；提示LOC554202過表達后，A2780細胞株中LOC554202相對表達量顯著上調，而miR-98-5p相對表達量顯著下調。siRNA-LOC554202組A2780細胞株LOC554202相對表達量為0.563±0.057，低于siRNA-NC組的1.000±0.021，比較差異有統計學意義(t=12.516，P<0.001)；siRNA-LOC554202組A2780細胞株miR-98-5p相對表達量為1.472±0.088，高于siRNA-NC組的1.001±0.042，比較差異有統計學意義(t=8.834，P=0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780細胞株中LOC554202相對表達量顯著下調，miR-98-5p相對表達量顯著上調。見圖4、5。

圖4 過表達或敲降LOC554202對 A2780細胞株中LOC554202表達的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=12.516，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=8.863，P=0.001

2.4 過表達或敲降LOC554202對A2780/DDP細胞株miR-98-5表達的影響pcDNA3.1-LOC554202組A2780/DDP細胞株LOC554202相對表達量為2.411±0.193，高于pcDNA3.1組的1.001±0.064，比較差異有統計學意義(t=12.016，P<0.001)；pcDNA3.1-LOC554202組A2780/DDP細胞株miR-98-5p相對表達量為0.620±0.058，低于pcDNA3.1組的1.001±0.049，比較差異有統計學意義(t=8.683，P=0.001)；提示LOC554202過表達后，A2780/DDP細胞株中LOC554202相對表達量顯著上調，而miR-98-5p相對表達量顯著下調。siRNA-LOC554202組A2780/DDP細胞株LOC554202相對表達量為0.432±0.012，低于siRNA-NC組的1.000±0.035，比較差異有統計學意義(t=26.545，P<0.001)；siRNA-LOC554202組A2780/DDP細胞株miR-98-5p相對表達量為1.499±0.057，高于siRNA-NC組的1.000±0.036，比較差異有統計學意義(t=12.723，P<0.001)；提示LOC554202敲降后，A2780/DDP細胞株中LOC554202相對表達量顯著下調，miR-98-5p相對表達量顯著上調。見圖6、7。

圖5 過表達或敲降LOC554202對 A2780細胞株中miR-98-5p表達的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=19.874，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=8.834，P=0.001

2.5 LOC554202對A2780細胞株和A2780/DDP細胞株增殖的影響對于A2780細胞株和A2780/DDP細胞株，LOC554202過表達均可顯著抑制細胞增殖(F=112.060，P<0.001；F=74.988，P<0.001)，而LOC554202敲降均可顯著促進細胞增殖(F=39.842，P<0.001；F=34.087，P<0.001)。見圖8。

2.6 LOC554202對A2780細胞株和A2780/DDP細胞株IC50的影響對于A2780細胞株和A2780/DDP細胞株，LOC554202過表達均可顯著降低細胞的IC50，而LOC554202敲降均可顯著提升細胞的IC50。見圖9。

3 討論

卵巢癌惡性程度高，起病隱匿，大多數被發現時已處于臨床Ⅲ～Ⅳ期。卵巢癌細胞減滅術和鉑類聯合紫杉醇化療是晚期卵巢癌患者的標準治療方案，但超過25%的患者會發生對鉑類的耐藥，并且部分耐藥患者對后續鉑類化療方案的反應性不足30%[2-3]。

圖6 過表達或敲降LOC554202對 A2780/DDP細胞株中LOC554202表達的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=12.016，P<0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=26.545，P<0.001

圖7 過表達或敲降LOC554202對 A2780/DDP細胞株中miR-98-5p相對表達量的影響

pcDNA3.1組和pcDNA3.1-LOC554202組比較，t=8.683，P=0.001；siRNA-NC組和siRNA- LOC554202組比較，t=12.723，P<0.001

編碼lncRNA LOC554202的基因位于9p21.3。在不同腫瘤組織中，LOC554202可表現為癌基因或抑癌基因的作用[4]。LOC554202在胃癌細胞中過表達，可能通過下調p21和E-cadherin的表達水平促進胃癌增殖和遷移[5]。敲降LOC554202會降低乳腺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并在體外抑制遷移或侵襲，在體內抑制腫瘤發生[6]。高水平的LOC554202預示宮頸癌預后不良[7]。LOC554202在直腸癌中低表達，并與病理分期和腫瘤大小密切相關；其過表達在體外降低細胞增殖、誘導細胞凋亡，并在體內阻礙了腫瘤的發生[8]。LOC554202通過上調miR-31表達促進非小細胞肺癌的獲得性吉非替尼耐藥[4]。過表達的LOC554202提示奧沙利鉑治療的結直腸癌患者預后良好[9]。

圖8 LOC554202對A2780細胞株和A2780/DDP細胞株增殖的影響

圖9 LOC554202對A2780細胞株和A2780/DDP細胞株IC50的影響

miR-98-5p屬于let-7家族成員。miR-98-5p在乳腺癌中起抑癌作用[10]。LncRNA SNHG4通過抑制miR-98-5p的表達促進肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化[11]。HEIH可以通過miR-98-5p/HECTD4軸促進膽管細胞癌的發生和發展[12]。miR-98-5p可通過天冬酰胺連接的糖基化3對非小細胞肺癌起到負調控的作用[13]。miR-98-5p的過表達與卵巢上皮性癌患者的DDP耐藥性和不良預后有關，其過表達顯著增強卵巢上皮性癌對DDP治療的耐藥性[14]。攜帶成纖維細胞驅動的外泌體攜帶過表達的miR-98-5p，可通過下調p21細胞周期蛋白依賴性激酶4抑制劑1A促進卵巢癌對DDP的耐藥[15]。

本研究結果顯示:相較于A2780細胞株，A2780/DDP細胞株中LOC554202呈低表達，miR-98-5p呈過表達。說明LOC554202和miR-98-5p可能與卵巢癌DDP耐藥相關。隨后進行的生物信息學分析和實驗證實LOC554202是miR-98-5p的靶標。在A2780細胞株和A2780/DDP細胞株中，LOC554202的過表達和敲降均會導致miR-98-5p相對表達量的顯著下調和上調，并可影響細胞的增殖能力和耐藥。這說明無論在A2780細胞株中，還是在A2780/DDP細胞株中，LOC554202均可通過ceRNA調控miR-98-5p的表達，且LOC554202均可顯著影響細胞的增殖和耐藥。

綜上所述，lncRNA LOC554202和miR-98-5p可能與卵巢癌DDP耐藥相關，LOC554202可通過ceRNA調控miR-98-5p的表達，調控卵巢癌DDP化療的耐藥。