氧化鋅納米顆粒誘導促死亡自噬殺傷腎癌細胞的實驗研究

張鵬飛，張 力，王 輝，楊荷宇，梁朝朝

近年來泌尿系統惡性腫瘤的發病率不斷上升，最新數據[1]顯示，2019年全美預計新發腎癌病例為73 820例，預計死亡病例為14 770例，腎癌的防治形式十分嚴峻。腎癌病理分型中腎透明細胞癌約占60%～85%，且幾乎所有的轉移性腎癌的病理類型都為腎透明細胞癌[2]。早期局限性腎癌患者可行手術治療，而轉移性腎癌患者對放化療不敏感，免疫治療效果亦欠佳[3]。因此，如何擺脫轉移性腎癌的治療困境是臨床上亟待解決的難題。

納米材料是指至少在三維空間中的一維處于納米尺度范疇內的材料，氧化鋅納米顆粒(Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs)因其優良的生物相容性在顯影、抗菌、傷口愈合等方面得到廣泛的應用[4]。在腫瘤治療領域，ZnO NPs具有極佳的抗腫瘤及藥物遞送的潛能[5-6]，并且可通過在腫瘤細胞中誘導自噬進而產生殺傷效應[7]。該實驗主要探究ZnO NPs的抗腫瘤作用，并通過與自噬抑制或增強劑的聯用，觀察不同處理條件對腎透明細胞癌Caki-1細胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑ZnO NPs(44299)購自中國Alfa Aesar公司;DMEM培養基(319-005-CL)及胎牛血清(086-150)購自美國Wisent公司;胰蛋白酶(25300054)及青鏈霉素(15070063)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;MTT(T0793)購自中國Bio Basic公司;抗LC3B抗體(NB100-2220)購自美國Novus Biologicals公司;GAPDH抗體(E-AB-20059)及Goat Anti-Rabbit IgG(E-AB-1034)購自中國Elabscience公司;渥曼青霉素(S1952)購自美國Selleck公司;氯喹(C6628)購自美國Sigma-Aldrich公司，二甲基亞砜及海藻糖購自德國NEO FROXX公司。

1.2 細胞株及細胞培養人腎癌Caki-1細胞株購自中國科學院細胞庫(北京)，在含10%胎牛血清的DMEM培養液中(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)培養，細胞在相對濕度為95%、37 ℃、5% CO2的環境中生長，定期換液傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞活力檢測(MTT法)Caki-1細胞以2×104/ml接種于96孔板，每孔體積100 μl，在CO2培養箱中培養12～24 h，待細胞貼壁后，加入不同濃度或種類的藥物定容至100 μl，每組設4個復孔，細胞加藥培養24 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl。繼續在培養箱里培養4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，于室溫下震蕩10 min中后，使用酶聯免疫檢測儀490 nm測定各孔吸光度。同時設置對照組，計算細胞活力。

1.4 細胞死亡測定Caki-1細胞以2×104/ml接種于96孔板，每孔體積100 μl，在CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁，加入不同的藥物定容至100 μl，每組設4個復孔，細胞加藥培養24 h后，吸棄培養液，PBS清洗2次，細胞用Hoechst33342(10 μg/ml)和 PI(10 μg/ml)染色 10 min 后，PBS清洗1次，隨后，借助熒光顯微鏡觀察以評估細胞死亡情況。結果用代表死亡細胞的 PI陽性(紅色)細胞數與代表總細胞的Hoechst陽性(藍色)細胞數的比率表示細胞死亡率。

1.5 Western blot檢測標志蛋白RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，12 000 r/min離心8 min后，轉移上清液至新離心管中，BCA法測定蛋白濃度后并調節蛋白濃度一致，按比例加入上樣緩沖液后沸煮8～10 min。在電泳緩沖液中進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質轉移至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1.5 h，加入1 ∶ 1 000的LC3一抗或1 ∶ 1 000的GAPDH一抗，4 ℃過夜，TBST洗5次，加相應二抗孵育1 h，TBST洗膜4次后顯色發光。

2 結果

2.1 ZnO NPs的理化表征透射電鏡圖像顯示ZnO NPs大多為分散的、長梭型顆粒(圖1A)；動態光散射分析(圖1B)表明，ZnO NPs的平均粒徑約為110 nm。

2.2 ZnO NPs對Caki-1細胞增殖抑制效應設置不同濃度(1、5、10、15、20、25 μg/ml)的ZnO NPs，Caki-1細胞用不同濃度的ZnO NPs處理24 h后，利用MTT法檢測細胞活力(圖2A)。可見細胞活力隨ZnO NPs濃度的增加而下降。同時,用15 μg/ml的ZnO NPs分別處理細胞6、12、24 h(圖2B)后，MTT法檢測后發現，細胞活力亦隨著時間的增加而降低。由此可見，ZnO NPs對Caki-1細胞具有劑量和時間依賴性的殺傷效應。

2.3 ZnO NPs在Caki-1細胞中誘導自噬的產生自噬是一個動態連續的細胞內降解過程。當自噬發生時,存在于胞質中的微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)一型(LC3-Ⅰ)會被特異性地剪切成綁定在自噬體膜上的LC3-Ⅱ,故通過Western blot檢測LC3-Ⅱ蛋白的積累可以動態檢測自噬的發生。

圖1 ZnO NPs理化表征

A：ZnO NPs透射電鏡圖×8 000；B：ZnO NPs的動態光散射分析

圖2 ZnO NPs對Caki-1的細胞活力的影響

A：不同濃度的ZnO NPs對Caki-1細胞活力的影響；B：不同時間下15 μg/ml ZnO NPs對Caki-1細胞活力的影響; 與對照組(0 μg/ml)比較：***P<0.001；與對照組(0 h)比較：##P<0.01，###P<0.001

圖3 ZnO NPs與自噬抑制劑對Caki-1細胞LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

A：不同ZnO NPS濃度下LC3-Ⅱ蛋白表達情況；B：15 μg/ml ZnO NPs不同時間下LC3-Ⅱ蛋白表達情況；C：ZnO NPs與Wort共處理后LC3-Ⅱ蛋白表達情況; D：ZnO NPs與CQ共處理后，LC3-Ⅱ蛋白表達情況；與0 μg/ml比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；與0 h比較：###P<0.001；與對照組比較：△△△P<0.001,△P<0.05；與ZnO組比較：▲▲▲P<0.001；a：對照組；b：ZnO組；c：Wort組；d：Wort+ZnO組; e：CQ組；f：CQ+ZnO組

用不同濃度的ZnO NPs處理細胞24 h后，Western blot結果顯示，隨著ZnO NPs濃度的增加，LC3-Ⅱ蛋白的積累也在不斷增加(圖3A)。此外，用15 μg/ml的ZnO NPs分別處理細胞6、12、24 h。圖3B的實驗結果顯示LC3-Ⅱ的積累隨著時間的增加也在不斷增加。由此可見，ZnO NPs可誘導Caki-1細胞產生劑量和時間依賴性的自噬效應。渥曼青霉素(wortmannin，Wort)作為一種經典的自噬抑制劑,已經被證明通過抑制Class Ⅲ PI3K來抑制自噬起始的發生。 將1 μmol/L的Wort與15 μg/ml的ZnO NPs聯合處理細胞24 h后，發現LC3-Ⅱ蛋白的積累顯著減少(圖3C)。氯喹(chloroquine, CQ)是一種可以通過中和溶酶體的酸堿度來抑制自噬底物降解的自噬抑制劑。為了更好的驗證ZnO NPs誘導的自噬是通過誘導原始自噬體的形成而非抑制自噬底物的降解，使用CQ來進一步驗證這一發現。將相同濃度的ZnO NPs與10 μmol/L的CQ共處理caki-1細胞24 h后，LC3-Ⅱ積累較單獨處理進一步增加(圖3D)。

圖4 ZnO NPs與自噬抑制或增強劑對Caki-1細胞的細胞活力檢測及ZnO NPs與自噬增強劑對Caki-1細胞的LC3-Ⅱ蛋白表達的影響

A： ZnONPs與Wort共處理后細胞活力改變；B：ZnO NPs與CQ共處理后細胞活力改變；C：ZnO NPs與Trehalose共處理后，LC3-Ⅱ蛋白表達情況；D：ZnO與Trehalose共處理后細胞活力改變；與對照組比較：***P<0.001,**P<0.01；與ZnO組比較：##P<0.01,#P<0.05；a：對照組；b：ZnO組；c：Wort組；d：Wort+ZnO組；e：CQ組；f：CQ+ZnO組；g：Trehalose組；h：Trehalose+ZnO組

由此可見，ZnO NPs誘導的自噬是由于自噬體的合成增多而非抑制自噬底物的降解。

2.4 抑制自噬逆轉ZnO NPs對Caki-1細胞的殺傷用15 μg/ml的ZnO NPs分別與2種不同的自噬抑制劑Wort(1 μmol/L)、CQ(10 μmol/L)共處理后，用MTT法檢測細胞活力(圖4A、B)。實驗結果顯示，在ZnO NPs單獨處理后，Caki-1細胞的細胞活力為(37.70±1.76)%,而在ZnO NPs+Wort處理組和ZnO NPs+CQ處理組中，細胞活力為(80.71±2.08)%(t=21.01，P<0.01)和(82.63±2.08)%(t=21.97，P<0.01)，均明顯高于ZnO NPs單獨處理組，差異有統計學意義。結果證明ZnO NPs導致的腎癌細胞殺傷效應在Wort或CQ存在的條件下得到大幅度地降低，抑制自噬可以逆轉ZnO NPs對腎癌細胞的殺傷，同時證明ZnO NPs在Caki-1細胞中誘導促死亡的自噬效應。

2.5 增強自噬促進ZnO NPs對Caki-1細胞的殺傷根據上述實驗結果推測增強自噬可能會提高ZnO NPs對腎癌細胞的殺傷效率。為進一步驗證這一假設，首先利用Western blot檢測ZnO NPs與自噬增強劑海藻糖(Trehalose)聯合處理后細胞LC3-Ⅱ蛋白的變化，顯示ZnO NPs所引起的LC3-Ⅱ的積累相較于ZnO NPs單獨處理組的確有所增多(圖4C)。之后再次使用MTT法檢測Caki-1細胞在15 μg/ml的ZnO NPs與100 mmol/L的Trehalose聯合處理24 h后的細胞活力。顯示ZnO NPs單獨處理組的細胞活力為(37.98±2.07)%，ZnO NPs+Trehalose處理組的細胞活力為(18.45±1.60)%，兩組間差異有統計學意義(t=12.94，P<0.05)。上述結果證明ZnO NPs與Trehalose的聯用可加強ZnO NPs對Caki-1細胞的殺傷(圖4D)。

最后利用Hoechst33342/PI雙染及imageJ軟件統計分析死細胞數及相應的死亡率(圖5)，結果表明，ZnO NPs+Wort處理組細胞死亡率(16.59±2.22)%及ZnO NPs+Trehalose處理組的細胞死亡率(90.56±6.17)%分別與ZnO NPs單獨處理組的細胞死亡率(67.74±5.42)%相比，差異均有統計學意義(t=15.26，P<0.001；t=4.832，P<0.01)。

圖5 Hoechst/PI染色比較不同藥物處理下的細胞活力的變化×40 標尺=1 mm

綜上所述，ZnO NPs在Caki-1細胞中可誘導促死亡的自噬效應，抑制自噬效應可以逆轉ZnO NPs對腎癌細胞的殺傷，增強自噬效應可提高其對腎癌細胞的殺傷效應。

3 討論

腎細胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，起病隱匿。早期局限性腎細胞癌患者預后較好，但轉移性腎細胞癌患者手術治療較為局限，預后較差，因此轉移性腎癌的非手術治療一直是臨床上亟待解決的難題。然而，腎透明細胞癌具有多藥耐藥性及生物學異質性，對傳統放化療不敏感。此外，細胞因子療法中無論是干擾素-α、白細胞介素-2的單用還是兩者的聯用，其治療效果仍然有限，新興的免疫療法及靶向藥的應用臨床獲益亦較小[8]。但值得注意的是，將納米材料開發為藥物或藥物載體來殺傷腫瘤細胞這一新興治療手段已經成為腫瘤診療領域的研究熱點。

近年來，ZnO NPs憑借其優越的性能獲得研究者們極大的關注。ZnO NPs被證明在體內安全性較高，且ZnO NPs的粒徑較小，更容易被機體所吸收。考慮到納米氧化鋅的獨特優勢，納米氧化鋅逐漸被開發為具有良好生物相容性和生物降解性的納米藥物或載藥平臺，從而被廣泛地應用于腫瘤診療領域[9]。國內學者[10]證明納米氧化鋅通過激活PINK1/Parkin介導的線粒體自噬來有效實現對Cal 27口腔癌細胞的殺傷。Ruenraroengsak et al[11]將氧化鋅與金納米星通過介孔硅耦聯來實現對耐藥性侵襲性乳腺癌細胞的有效殺傷。Kundu et al[12]發現將姜黃素搭載在苯硼酸修飾的納米氧化鋅后，該材料可以被靶向遞送到乳腺癌細胞中，并實現pH響應地靶向藥物釋放。目前，ZnO NPs抗腫瘤機制尚未完全闡明。有學者[7,13]認為ZnO NPs可通過鋅離子的釋放來增加活性氧的產生，誘發細胞內的氧化還原級聯反應，從而引起不可修復的氧化應激損傷。還有一部分研究者[6]認為，氧化鋅納米粒子可被動吸收或內吞進入細胞中，直接與細胞內的蛋白和細胞器相互作用，并可通過自噬、損傷DNA、凋亡等其他途徑最終導致腫瘤細胞死亡。此外，鋅介導的蛋白質活性失衡也被認為是導致腫瘤細胞死亡的另一重要原因[14]。

雖然納米氧化鋅的抗腫瘤效應在很多類型的腫瘤中已經得到驗證，但其在腎癌細胞中的研究并不多見。故課題組選用腎透明細胞癌Caki-1細胞株作為實驗細胞系。本實驗中首先評估了納米氧化鋅對Caki-1細胞的生長抑制作用，顯示隨著納米氧化鋅濃度的增加，Caki-1細胞的生長抑制越明顯。選擇15 μg/ml作為后續試驗中納米氧化鋅的一般濃度，表明納米氧化鋅對Caki-1細胞的生長抑制作用亦存在時間依賴性。細胞自噬是一種公認的細胞死亡途徑，而自噬體的聚集又多與納米材料暴露于細胞并通過胞吞作用進入細胞有關。LC3-Ⅱ蛋白作為經典的自噬特征蛋白，其積累水平的高低代表了自噬水平的高低。因此，為了在蛋白層面驗證是否有自噬的發生，課題組利用Western blot實驗檢測納米氧化鋅處理Caki-1細胞后，細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達變化。隨后觀察到納米氧化鋅處理Caki-1細胞后的確可以導致LC3-Ⅱ蛋白的積累增多，且LC3-Ⅱ蛋白的積累亦具有劑量及時間依賴性，得出在納米氧化鋅處理后，細胞的自噬水平與細胞活力存在一種潛在的負相關性。為此，課題組利用自噬抑制劑(Wort、CQ)及自噬增強劑(Trehalose)分別與ZnO NPs共處理，顯示自噬效應部分被抑制后，納米氧化鋅的細胞殺傷作用被減弱，自噬效應在人為提升后，納米氧化鋅的細胞殺傷作用得到了進一步提高。