電針對PTSD樣大鼠學習記憶及海馬CA1區Bcl-2/Bax表達的影響

劉倩汝，王 麗，祁 鳴，于 海，張桂青

《精神疾病診斷與統計手冊》第五版將創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder, PTSD)描述為以一種或多種方式接觸實際的或被威脅的嚴重暴力或創傷性事件而誘發的一類精神疾病，且常伴有注意力偏離與分離性遺忘[1]。PTSD患者海馬體積縮小，神經元有凋亡現象[2-3]，而海馬體在記憶存儲、定向與提取中扮演重要角色，有研究[4-5]表明，電針對PTSD認知功能損害有效，但作用機制尚未闡明。現欲以單次延長應激(single prolonged stress, SPS)建立的PTSD樣大鼠模型為切入點，借助Morris水迷宮、HE染色和Western blot等研究手段，探討電針對PTSD樣大鼠記憶功能及海馬CA1區凋亡相關因子Bcl-2/Bax表達的影響，以進一步揭示電針治療PTSD的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只成年清潔級雄性Sprague Dawley大鼠，180～220 g，購自新疆疾病控制動物中心[動物編號：SCXK(新)2019-0032]；飼養環境：室溫(24±1) ℃，相對濕度50%～60%，晝夜12 h/12 h交替，保持通風，自由攝食、飲水，動物實驗的開展符合本單位醫學倫理部門的有關規定。

1.2 主要試劑Anti-Bcl-2兔多克隆抗體、Anti-Bax小鼠單克隆抗體(英國abcam公司，貨號ab196495、ab77566)；β-actin內參抗體、HPR標記羊抗兔、羊抗小鼠二抗(英國abcam公司，貨號ab205718、ab205719)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(上海歌凡生物技術有限公司，貨號M020)。

1.3 模型制備采用SPSS22.0軟件將大鼠隨機等分為正常對照組、模型組、電針組和電針對照組，依據課題組前期造模方法[6]，對模型組和電針組大鼠做如下處理：① 禁錮2 h；② 強迫性游泳20 min，其中水深35 cm，水溫25 ℃，休息15 min；③ 99.5%的無水乙醚麻醉箱中麻醉至意識喪失，不能站立，后立即取出。電針組和電針對照組在造模6 h內，參照相關文獻[7-8]，將大鼠固定在支架上，取“百會”、“大椎”和“足三里”，沿皮下緩慢進針，深度為5 mm，連接電針儀，疏密波，頻率為5～10次/s，至大鼠肌肉輕微震顫為宜，每次15 min，持續14 d。

1.4 模型評估分別通過曠場實驗和Morris水迷宮實驗測試4組大鼠的情緒喚醒水平和學習記憶能力。① 曠場實驗：自制曠場實驗箱，規格為900 mm×900 mm×500 mm，底部為16個等大小方格，上方與紅外攝像儀相連，數據采集時間為5 min，記錄參數為大鼠在曠場中的直立次數與跨格次數；② Morris水迷宮實驗：前5 d為定位航行能力測試，將大鼠面向迷宮內壁置入池內，若60 s內大鼠找到水中站臺并停留5 s，則同步的計算機停止跟蹤，若找不到，則引導大鼠登到水中站臺，并停留10 s，使其充分感受周圍的空間位置信息，重復4次，記錄平均上臺潛伏期。第6天為空間探索能力測試，移除水下站臺，將大鼠從第2、3和4象限(非站臺所在象限)的任意一個方位面壁置入池內1次，記錄其穿臺潛伏期(即穿過原站臺所在位置所需時間)和穿臺次數。

1.5 海馬組織提取與HE染色完成模型評估后采用3%水合氯醛30 mg/kg對4組大鼠行腹腔麻醉，暴露胸腔，剪開右心耳開始放血，隨后向大鼠心臟以50 ml/min的速度推注生理鹽水灌洗液，直至從右心耳流出的液體變得清亮，后迅速斷頭取腦，在冰上采用玻璃分針剝離雙側海馬組織，一側在液氮罐中保存24 h后于-80 ℃冰箱封存待用，另一側經10%甲醛溶液固定30 min后行50%、70%、80%、95%和100%梯度酒精脫水，后在二甲苯中進行透明化處理，經浸蠟、包埋、切片、脫蠟與染色、漂洗、復染和封藏等一系列常規處理后，制作組織切片。光學顯微鏡下觀察各組大鼠海馬CA1組織形態特點。

1.6 Western blot法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達取先前凍存的海馬組織100 mg，用眼科剪剪碎，置于含1% PMSF的預冷RIPA裂解液中，充分裂解30 min，于勻漿器中勻漿，15 000 r/min離心15 min，取上清液，后稀釋、孵育，利用吸光度(optical density, OD)值測定樣本蛋白濃度，煮沸冷卻備用；配備5%的濃縮膠和10%的分離膠，恒壓100 V電泳90 min，后將蛋白轉膜至PVDF膜上(恒壓80 V、60 min)，PBST洗膜8 min×3次，5%脫脂牛奶封閉2 h，敷一抗(Bcl-2及Bax，1 ∶ 800，β-actin，1 ∶ 1 000)，于4 ℃冰箱過夜，PBST洗膜10 min×3次、8 min×5次，敷二抗(HPR標記羊抗兔，稀釋比例為1 ∶ 5 000)2 h，PBST洗膜5 min×4次、10 min×3次，暗室中采用ECL化學發光法曝光顯色，用BandScan軟件得出膠片灰度值。

2 結果

2.1 曠場實驗站立與跨格次數比較與正常對照組比較，模型組大鼠站立次數與跨格次數均減少；與模型組比較，電針組大鼠站立與跨格次數均增多，差異有統計學意義(P<0.05)，其中正常對照組和電針對照組大鼠兩項指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 曠場實驗各組大鼠站立與跨格次數比較

1: 正常對照組; 2: 模型組; 3:電針組; 4: 電針對照組; 與正常對照組比較:*P<0. 05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 Morris水迷宮實驗在定位航行能力測試階段，前2 d各組大鼠平均上臺潛伏期差異無統計學意義(P>0.05)，第3天開始，與正常對照組比較，模型組大鼠平均上臺潛伏期延長；與模型組比較，電針組大鼠平均上臺潛伏期縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)。在空間探索能力測試階段，移除水下20 mm處的站臺，與正常對照組比較，模型組大鼠穿臺潛伏期延長，穿臺次數減少；與模型組比較，電針組大鼠臺潛伏期縮短，穿臺次數增多，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中正常對照組和電針對照組大鼠以上指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 海馬組織HE染色結果與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區海馬經元排列紊亂，結構異常，且胞核和胞質界限較模糊，與模型組大鼠比較，電針組大鼠海馬組織CA1區神經元排列較整齊，結構趨于正常，正常對照組和電針對照組大鼠海馬組織CA1區神經元形態結構比較未見明顯差異。見圖2。

2.4 大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達各組大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達存在差異(F=154.50,P<0.05;F=42.67,P<0.05)。與正常對照組(0.345±0.034；0.193±0.031)比較，模型組(0.606±0.049；0.325±0.054)大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組(0.364±0.034；0.175±0.035)大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，正常對照組和電針對照組(0.321±0.027；0.165±0.034)大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

表1 Morris水迷宮實驗大鼠上臺潛伏期、穿臺潛伏期和穿臺次數的比較

與正常對照組比較:*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖2 各組大鼠海馬組織CA1區HE染色×400

A: 正常對照組; B: 模型組; C:電針組; D: 電針對照組

3 討論

近年來隨著對PTSD研究的深入，除了典型的三大核心癥狀，即與創傷事件有關的侵入性記憶、持續回避與創傷事件有關的內容和與創傷事件有關的警覺性或反應性明顯改變，人們開始更加關注創傷暴露者認知和心境方面的負性改變[1]，記憶力是認知功能的核心，而動物模型的引入為人們研究PTSD記憶力減退的發病機制提供了可能。中醫認為，腦為元神之府，是調節人們精氣神、認知、情緒情感和意志過程的集大成者，人體陽氣蒸騰上行，填濡髓海，督脈循行于后背正中線，與六條陽經均有交匯，百會位居大腦巔頂，可升陽益氣，醒腦寧神，為督脈要穴，大椎為督脈、手、足三陽脈交會穴，可調臟腑機能，足三里可補益氣血，治療下肢痿痹，百會、大椎和足三里三穴的貫通與配合有滋養血脈，提升心智的功效。

1: 正常對照組; 2: 模型組; 3: 電針組; 4: 電針對照組; 與正常對照組比較:*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

曠場實驗是測試實驗動物情緒喚醒水平和自主運動的經典行為學實驗[9]，模型建立及電針干預后，與正常對照組比較，模型組大鼠在曠場中站立與跨格次數均減少，行為顯呆滯、刻板；與模型組比較，電針組大鼠站立與跨格次數均增多，行為顯主動、活躍，情緒喚醒水平增強，對周圍事物的興趣增加。積極的行為活動可提升個體的內在自我認知[10]，進而影響其對周圍信息的判斷和評價，Morris水迷宮實驗可通過定位航行和空間探索兩個方面對實驗動物的學習記憶能力進行評估[11]，從第3天開始，與模型組組比較，電針組和正常對照組大鼠平均上臺潛伏期縮短，定位航行能力明顯提升；在第6天的空間探索階段，撤去水下站臺后，與模型組比較，電針組和正常對照組大鼠多次穿過水下站臺且穿臺時間很短，對水下站臺位置的感知能力明顯更強，這與李艷鳴 等[12]研究結果類似，電針治療提升了PTSD模型大鼠的學習記憶表現。

徐愛軍 等[13]研究表明，SD大鼠接受SPS應激后，學習記憶能力減退，海馬神經元凋亡相關因子Bcl-2/Bax表達均上調，未行干預治療。在本次研究中，在行為學檢測后，以對創傷應激最為敏感的大鼠海馬組織CA1區為切入點，HE染色結果顯示，模型組大鼠海馬經元排列紊亂，結構異常，且胞核和胞質界限較模糊；電針組大鼠海馬組織CA1區神經元排列較模型組更整齊，結構已趨于正常，這或許可以從形態學的角度解釋PTSD樣大鼠認知記憶能力減退的原因。細胞凋亡包括誘導、調控和效應3個步驟和線粒體、死亡受體和內質網等3個主要途徑，其中以線粒體依賴途徑最為重要，Bcl-2基因為優秀的抗凋亡基因代表，對促凋亡因子Bax有著直接的拮抗作用，Bcl-2/Bax蛋白均在線粒體上游，能有效調控凋亡啟動因子cyt-c的釋放，進而激活重要的凋亡執行者caspase-3，從而介導細胞的存活或死亡[14]。Western blot結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達均升高，與模型組比較，電針組Bcl-2/Bax蛋白表達均降低，表達量恢復正常，電針治療可改善PTSD樣大鼠的學習記憶能力，可能與下調海馬組織CA1區Bcl-2/Bax蛋白表達有關。值得注意的是，在上述幾個方面，正常對照組和電針對照組均未表現出明顯差異，表明對于正常健康SD大鼠而言，電針治療不會對其情緒喚醒以及行為變現產生干擾，全部選用雄性大鼠，旨在避免雌性動物體內周期性激素水平變化對實驗的影響。