橋本甲狀腺炎鼠動情周期子宮內(nèi)膜半乳糖凝集素-1含量變化

高偉偉，李 莉，樊 華，楊 昊，柳田田，王 囡，朱德發(fā)

橋本甲狀腺炎屬于自身免疫性疾病之一，主要發(fā)生于女性人群[1]。研究[2]顯示，不孕女性具有較高的橋本甲狀腺炎發(fā)生率。因此，對橋本甲狀腺炎與女性妊娠的關系進行深入研究尤為重要。人及哺乳動物的子宮內(nèi)膜經(jīng)過短暫的“著床窗口期”才允許胚胎著床，這一過程受到各種信號物質(zhì)、細胞因子的調(diào)節(jié)。半乳糖凝集素家族成員在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應以及腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等一系列生理過程中發(fā)揮著重要作用[3]。既往，半乳糖凝集素-1(galactose agglutinin-1, galectin-1)在腫瘤疾病的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等方面的相關研究較多，由于胚胎著床和腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學行為存在高度相似，因此近年來galectin-1于生殖領域中的相關研究日益增多。有研究[4]報道，galectin-1與妊娠的維持和成功存在一定相關性，被認為可能是子宮內(nèi)膜容受性的標志物之一。鑒于此，現(xiàn)通過研究子宮內(nèi)膜厚度的改變及galectin-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-17a(interleukin-17a，IL-17a)含量關系，為臨床研究橋本甲狀腺炎和不孕的關系提供線索，同時為橋本甲狀腺炎患者不孕癥的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取8～9周齡的清潔級健康NOD雌性小鼠共40只，體質(zhì)量20～23 g,均購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學病理科實驗室。所有小鼠均予以自然晝夜節(jié)律光照，控制室內(nèi)溫度20～24 ℃、濕度40%～60%，適應性飼養(yǎng)7 d。小鼠實驗方式嚴格遵守倫理學原則，且與安徽醫(yī)科大學實驗動物管理相關條例相符。

1.2 研究方法

1.2.1橋本甲狀腺炎造模 40只小鼠隨機均分為2組，經(jīng)7 d適應性飼養(yǎng)后，取25 μg的豬甲狀腺球蛋白加入100 μl的PBS溶液中混勻，按照1 ∶ 1的比例取弗氏完全佐劑與豬甲狀腺球蛋白溶液混合在研缽之內(nèi)，并于冰浴上研磨，直至其呈“油包水”狀。固定小鼠，采用一次性注射器抽取已制備好的乳狀劑于尾根部行皮下注射，注射劑量為0.1 ml。14 d后按照1 ∶ 1的比例將弗氏不完全佐劑和豬甲狀腺球蛋白混合制成乳化液，隨后按照上述方式進行操作。對照組小鼠注射等量不含有豬甲狀腺球蛋白的弗氏完全佐劑進行干預。造模成功與否由病理實驗室工作人員進行判定，成功模型的主要表現(xiàn)為甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)發(fā)生較為嚴重的破壞，且淋巴細胞浸潤比較明顯。

1.2.2動情周期確定 主要分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期，周期為4～5 d，在小鼠造模周期結(jié)束后1周內(nèi)進行小鼠陰道脫落細胞瑞士染色涂片，在確定動情周期后立即取靜脈血，以頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.3標本制備 迅速取出小鼠的完整“Y”形子宮，并從子宮分叉處剪斷。將左半子宮放置于4%的多聚甲醛中固定24 h，行石蠟包埋，作矢斷面連續(xù)切片，片厚5 μm，用于HE以及免疫組化染色。另一側(cè)子宮以4%的多聚甲醛固定，用于組織勻漿待行細胞因子檢測。

1.2.4血清抗甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TgAb)、甲狀腺抗過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平檢測 確定動情周期后的小鼠進行乙醚吸入法麻醉處理，隨后打開腹腔將下腔靜脈充分暴露，進行下腔靜脈采血。以3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存在4 ℃的冰箱中待檢。電化學發(fā)光免疫分析法檢測血清T3、T4、TgAb、TPOAb，ELISA法檢測血清TSH，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5染色 ① HE染色：小鼠子宮予以脫蠟、復水處理，以蘇木精染色20 min，隨后予以脫水處理，并于透明后烘干封片，采用光學顯微鏡進行圖片的拍攝。② 免疫組織化學染色：取小鼠子宮蠟片進行脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶操作，并以檸檬酸鹽微波爐加熱暴露抗原決定簇，以山羊血清封閉。上述各項操作結(jié)束后均采用PBS重復3次洗滌，3 min/次。加入galectin-1抗體(1 ∶ 50)于室溫下孵育1 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃條件下孵育過夜，采用PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片。隨機選取每張切片高倍鏡下5個視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進行免疫反應產(chǎn)物觀密度值的分析，取平均吸光度(average optical density,AOD)值。

1.2.6mRNA獲取 采用TRIzol試劑盒提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后以PCR擴增技術獲取mRNA，其中PCR反應體系20 μl，包括5 μl 2×SYBR Green mixture，正向(10 μmol/L)與反向引物(10 μmol/L)各1 μl，cDNA 1 μl，核糖核酸酶游離水 2 μl，總RNA 10 μl。反應條件如下：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，共40個循環(huán)。其中galectin-1正向引物為GCCTCCATGTGTTCTTGGTC，反向引物為CTCACCCTCTGTGGTCACTT。

1.2.7采用流式微球捕獲技術(CBA) 以CBA 人Th1/Th2/Th17細胞因子試劑盒檢測組織勻漿TNF-α、IL-17a水平。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒購自美國BD公司。

1.2.8觀察指標 分別比較2組小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平，HE染色鏡下拍照，多功能圖像分析儀測量動情期的子宮內(nèi)膜厚度水平，動情期、動情前期、動情后期、動情間期galectin-1 mRNA表達情況，組織勻漿TNF-α、IL-17a水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平對比觀察組小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比對照組較高(均P<0.05)。見表1。

2.2 兩組小鼠動情周期的子宮內(nèi)膜厚度水平對比觀察組小鼠動情期子宮內(nèi)膜厚度相比對照組更厚(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3 兩組小鼠動情周期galectin-1 mRNA表達情況對比觀察組小鼠動情各期galectin-1 mRNA表達水平相比對照組降低(P<0.05)。見表3。

2.4 兩組小鼠動情周期galectin-1 蛋白的AOD對比觀察組動情期和動情后期的galectin-1 蛋白的AOD值均較對照組更低(P<0.05)，而在動情前期和動情間期的AOD值與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 兩組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平對比觀察組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平相比對照組較低(均P<0.05)。見表5。

表1 2組小鼠TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH、水平

與對照組比較：*P<0.05

表2 兩組小鼠動情期的子宮內(nèi)膜厚度水平對比

與對照組比較：*P<0.05

表3 兩組小鼠動情周期galectin-1 mRNA表達情況對比

與對照組比較：*P<0.05

圖1 2組小鼠子宮內(nèi)膜動情周期 HE×100

表4 兩組小鼠動情周期galectin-1蛋白的AOD對比

組別動情期(n=8)動情前期(n=4)動情后期(n=4)動情間期(n=4)觀察0.165 7±0.002 9?0.083 1±0.002 50.081 4±0.002 1?0.042 8±0.002 7對照0.201 8±0.003 60.082 9±0.002 30.139 7±0.002 00.043 3±0.002 6t值22.0880.11840.2070.267P值<0.0010.910<0.0010.799

與對照組比較：*P<0.05

表5 兩組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平對比

與對照組比較:*P<0.05

3 討論

近年來的研究[5]發(fā)現(xiàn)不孕癥女性合并橋本甲狀腺炎的幾率高于生育能力正常的女性，這提示了橋本甲狀腺炎與不孕癥存在密切相關。本文采用豬甲狀腺球蛋白于尾根部行皮下注射，建立橋本甲狀腺炎模型。病理下觀察甲狀腺組織濾泡結(jié)構(gòu)發(fā)生較為嚴重的破壞，且淋巴細胞浸潤比較明顯，觀察組小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比對照組較高，這與既往研究[6]報道一致，提示造模成功。小鼠動情期相當于女性月經(jīng)周期的分泌期，為了有利于胚胎的順利植入及著床，動情期的子宮內(nèi)膜較其他3期明顯增厚。本實驗通過陰道涂片染色確定動情周期，結(jié)果表明觀察組小鼠存在動情周期，且節(jié)律與對照組無差異，提示動情周期的節(jié)律未受其疾病影響而改變。HE染色光鏡下觀察顯示觀察組鼠動情期子宮內(nèi)膜較同期對照組增厚、內(nèi)膜腺體增大、數(shù)量增多。推測機體免疫改變、炎性反應累及子宮內(nèi)膜。

實驗結(jié)果顯示觀察組小鼠galectin-1 mRNA水平低于對照組。同時，觀察組小鼠的galectin-1 蛋白的AOD值在動情周期出現(xiàn)了異常表達，動情期低于對照組。galectin-1主要表達在滋養(yǎng)細胞中，屬于母胎間相互作用的重要蛋白質(zhì)之一。其在胎盤植入、子宮螺旋動脈重鑄等過程中發(fā)揮著至關重要的作用，可通過誘導子宮免疫耐受性樹突細胞的擴張，對母胎界面的Th1/Th2免疫平衡產(chǎn)生影響，促進免疫耐受[7-8]。動情期作為妊娠過程關鍵時期，推測galectin-1 蛋白低表達可能減弱了細胞間識別黏附能力，以及增強誘導T細胞凋亡，促使免疫失衡，不利于妊娠的順利進行[9-10]。

本研究選取2組小鼠右半側(cè)子宮組織勻漿進行TNF-α、IL-17a水平測定，結(jié)果顯示觀察組小鼠TNF-α、IL-17a水平相比對照組均較低，提示存在免疫反應異常。TNF-α是一種由活化的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，除具有抗腫瘤作用外，還能夠激活T細胞、促進IL-21、IL-22等細胞因子的產(chǎn)生與分泌，促進炎癥及免疫反應。其中Aikawa et al[11]的研究表明，TNF-α已經(jīng)參與類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的發(fā)病過程中。IL-17a是IL-17家族中的重要成員，其可通過募集中性粒細胞、刺激巨噬細胞等多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生誘導炎癥級聯(lián)反應，并與TNF-α具有協(xié)同作用，加強致炎效應，目前已被證實[12]在RA等自身免疫性疾病中高表達，若敲除小鼠IL-17基因后，其自身免疫受到抑制。本研究對于TNF-α、IL-17a水平下降的原因，推測可能與galectin-1表達水平的下降有關。研究[13]表明，galectin-1可以抑制活化T細胞的增殖，促進其凋亡，抑制促炎性細胞因子的分泌并抵抗炎癥反應。另有報道[14]顯示，galectin-1的敲除可減弱對TNF-α的促增殖作用的抑制。上述提示了本實驗中galectin-1蛋白可能通過影響TNF-α、IL-17a兩種細胞因子的分泌來調(diào)節(jié)免疫反應并維持妊娠。

綜上所述，橋本甲狀腺炎小鼠動情期子宮內(nèi)膜厚度增加，動情期子宮內(nèi)膜galectin-1水平較對照組降低，且存在局部免疫反應，從而可能導致子宮內(nèi)微環(huán)境改變，對懷孕產(chǎn)生影響。