含轉導域重組神經肽對D-半乳糖致免疫衰老小鼠胸腺功能的影響

劉貞銀，梁 陽，歐陽軍，鄭丹丹，余榕捷，張華華

免疫衰老是指生物體的免疫系統隨年齡增加而產生的一系列退化、代償和重建。免疫衰老的主要歷程包括初始 T 細胞的耗竭、胸腺的退化、T 細胞受體的基因多態性消減、記憶/效應 T 細胞累積及衰老的慢性炎癥狀態。且胸腺的退化和萎縮是免疫衰老過程中最主要的免疫學表現，胸腺退化會直接導致胸腺內初始T細胞的發育障礙以及向外周T淋巴細胞輸出減少，從而導致 T 淋巴細胞介導的免疫能力減弱，使機體免疫自穩功能紊亂并加快衰老[1]。胸腺的狀態和功能直接影響機體的免疫功能, 胸腺的萎縮是機體免疫衰老的直接原因[2]。垂體腺苷酸環化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP)是一種多功能性神經多肽，與其衍生物均具有修復神經損傷、調節神經遞質/調質、保護神經細胞作用；參與 T 淋巴細胞分化、增殖以及調節相關免疫功能和維持機體免疫自穩等作用，而這些作用都基于活化的受體刺激細胞內第二信使 cAMP 的產生[3]。已有研究[4]表明，PACAP通過與免疫細胞上特定受體結合，在細胞免疫系統中發揮關鍵作用。為了使其有更好的穩定性及穿膜能力，利用基因重組制備技術重組神經肽: 含蛋白轉導域(protein transduction domain，PTD) 的重組 PACAP(PACAP-PTD)。它是一種介導大分子跨膜的運載工具，能夠穿透生物膜，介導各種分子在細胞之間自由傳遞，而且對機體細胞沒有明顯不良反應[5]。該研究從初始T 細胞耗竭、胸腺退化的角度展開系統研究，探討 PACAP 和 PACAP-PTD 對免疫衰老模型小鼠胸腺功能的影響, 初步明確其延緩免疫衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料半乳糖(北京 Solarbio 公司)；血液/細胞/組織全基因組 DNA 抽提試劑盒(北京天根公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒、TRIzol(美國Invitrogen公司)；Prime ScriptTMRT reagent 試劑盒、TAKARA TaqTMPCR 試劑盒(日本TaKaRa公司)；Anti-mouse CD3-PercpTMCy5.5、CD4-FITC、CD8-PE(美國 BD 公司)；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem 公司)；雄性BALB/c小鼠SPF級，許可證號：SCXK(粵)2011-0015，SPF級動物房飼養(南方醫科大學實驗動物中心)；Real-time PCR測定的引物見表1，由上海生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1D-半乳糖(D-Gal)致衰老模型小鼠的建立及生物學鑒定 6～8 周齡 BALB/c 雄鼠 30 只(18～22 g)隨機分成對照組和模型組，對照組5只小鼠，每天皮下注射生理鹽水(500 mg/kg)；模型組25只小鼠，注射等量 D-Gal 溶液，連續 42 d。整個實驗中小鼠自由飲水進食。最后一次注射后稱量小鼠體質量，摘眼球取血，處死小鼠并稱取脾臟和胸腺重量。胸腺、脾臟指數(mg/10 g)=臟器重量(mg)/[體質量(g)×10]。分別采用黃嘌呤氧化酶法、TBA 比色法測定血清中 SOD 活性和 MDA 含量。

1.2.2Real-time PCR測定衰老小鼠T細胞中sjTREC含量 D-Gal 致衰老小鼠模型18只，隨機分為D-Gal組、PACAP組、PACAP-PTD組，每組6只；PACAP組和PACAP-PTD組分別每天腹腔注射10 nmol/ml PACAP和 PACAP-PTD溶液(12.5 ml/kg)，D-Gal組腹腔注射等量的生理鹽水，連續注射14 d。

獲取胸腺和脾臟淋巴細胞，抽提基因組DNA，進行Real-time PCR反應,建立標準曲線,體系反應的條件：95 ℃ 2 min去UDG，95 ℃ 3 min預變性，95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，進行50個循環。制備標準以及陽性重組質粒。在同1次反應中，稀釋標準重組質粒反應組：108、107、106、105、104、103拷貝/μl，設置標準質粒陰性對照組、TREC片段PCR組、TREC陽性對照組、TREC陰性對照組、RAG2陽性對照組、RAG2片段PCR組，每組均設置兩個平行重復。由Real-time PCR反應Ct值和標準曲線得出樣本中RAG2和TREC的拷貝數(copies)，根據公式：[(TREC copies1 + TREC copies2)/(RAG2 copies1+RAG2 copies2)]×2×106計算出106個細胞中信號結合T細胞受體(T cell receptor,TCR)重排刪除環(signal joint T cell receptor rearrangement excision circles，sjTREC)的拷貝數。

1.2.3real-time PCR檢測衰老小鼠胸腺功能和狀態相關基因表達 獲取胸腺和脾臟細胞，抽提淋巴細胞 RNA，設計并合成引物，設置 42 ℃除去基因組 DNA，RNA 反轉錄成互補 DNA(cDNA)，進行逆轉錄real-time PCR反應，建立擴增曲線，體系反應：95 ℃ 30 s 預變性1次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環。在同 1 次反應中，設置樣品T 淋巴細胞易位蛋白(LIM domain only 2, LMO2)、白細胞介素-7(interleukin-7, IL-7)、叉頭蛋白N1(forkhead box protein N1,Foxn1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydE-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)片段PCR組和陰性對照組，每組均設置兩個平行重復；PCR反應完成后設定閾值，利用軟件輸出Ct值；根據比較Ct值法得到不同基因表達比率，公式為：2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.2.4流式細胞術檢測小鼠全血中CD3、CD4、CD8 加入100 μl EDTA抗凝血于離心管中，用紅細胞裂解液2 ml，室溫、裂解15 min(1 000 r/min離心5 min)，棄上清液；加入 1 ml PBS 緩沖液洗滌2次(1 000 r/min離心5 min)；用50 μl PBS緩沖液重懸細胞，細胞懸液移入流式管；每管分別加入2.5 μl Anti-mouse CD3-PercpTM Cy5.5、CD8-PE、CD4-FITC混勻，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛400 μl混勻固定樣品后，進行FACS Canto Ⅱ流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 D-Gal致衰老小鼠動物模型建立成功

2.1.1小鼠的生物學行為和一般狀態 小鼠注射D-Gal 溶液建立衰老模型，連續注射42 d后小鼠無死亡。與對照組相比，模型組小鼠呈現明顯衰老體征，脊椎漸現隆起，皮膚松弛，體型瘦削，毛發蓬松直豎且稀疏失去光澤，行動遲緩少動且喜蜷縮，對照組小鼠則無相應形態狀況。見圖 1。

2.1.2小鼠體質量及脾臟和胸腺指數變化 建立模型期間每周稱取小鼠體質量，與對照組小鼠比較，模型組小鼠體質量增長較慢。根據主效應和交互效應方差分析的結果顯示，不同時間之間體質量有差異(F=30.06，P<0.01)；時間與組別之間不存在交互效應(F=1.98，P>0.05)；模型組與對照組間體質量無差異(F=10.14，P>0.05)。單獨效應分析模型組與對照組做兩兩比較，從 35 d起模型組小鼠與對照組相比體質量有差異(35 d:t=5.02，P<0.01；42 d:t=6.40，P<0.01)。見圖2。建模完成后，模型組小鼠的胸腺及脾臟指數均低于對照組 (P<0.01)。見表2。

圖2 模型組與對照組小鼠體質量變化

表2 模型組與對照組小鼠胸腺和脾臟重量及指數的比較

與對照組比較：*P<0.01

2.1.3小鼠血清中SOD活力和MDA含量變化 與對照組比較，模型組小鼠血清中SOD活力下降，MDA含量升高，確定建模成功。見表3。

表3 D-Gal致衰老小鼠血清中SOD活力和MDA含量變化

與對照組比較：*P<0.01

2.2 衰老模型小鼠T細胞中sjTREC含量結果

2.2.1Real-time PCR反應 Real-time PCR反應后核酸擴增過程中的動力學曲線呈S型，熔解曲線為單一峰，證明了產物的特異性。見圖3。

2.2.2標準曲線 用梯度稀釋標準質粒的Ct值為縱坐標(Y)，標準質粒濃度自然對數為橫坐標(X)，得到一條直線型標準曲線，并獲得一元回歸方程：Y= -3.33X+43.05，斜率為-3.33，R2=0.999。保證了此方法的準確性。見圖4。

2.2.3Real-time PCR測定sjTREC含量的結果 經公式可以計算出各個樣本相同細胞數目中的TREC copies，從而進行樣本間的比較。Real-time PCR檢測顯示，與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組胸腺(F=27.24，P<0.01)和脾臟(F=59.90，P<0.01)T淋巴細胞中sjTREC含量上升(P<0.01)。PACAP組和PACAP-PTD組比較，胸腺(P<0.01)和脾臟(P<0.05)中sjTREC含量上升，差異有統計學意義。見圖5。

2.3 衰老小鼠胸腺功能和狀態相關基因表達結果

2.3.1Real-time PCR擴增 Real-time PCR反應最后可得到反應核酸擴增過程的S型動力學曲線和熔解曲線。擴增曲線呈S型，不同基因表達的熔解曲線為單一峰，證實了產物的特異性。見圖6。

圖3 Real-time PCR結果

圖4 標準曲線

2.3.2LMO2、Foxn1及IL-7基因表達 Real-time PCR檢測發現與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組胸腺LMO2基因表達下調(F=82.962，P<0.01)，IL-7和Foxn1基因表達均上調(F=348.86，P<0.01；F=219.11，P<0.01)。PACAP-PTD組較PACAP組IL-7和Foxn1基因表達上調差異大(P<0.01)，LMO2基因的表達下調差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖5 Real-time PCR測定胸腺和脾臟淋巴細胞中sjTREC水平

與D-Gal組比較：**P<0.01；與PACAP組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 小鼠全血中CD3、CD4、CD8變化

2.4.1CD3+CD4+/CD3+CD8+檢測 利用PercpTMCy5.5、FITC、PE 分別標記CD3+、CD4+、CD8+T細胞，流式分析結果表明PACAP組和PACAP-PTD組小鼠全血中CD3+CD4+T細胞比例均高于D-Gal組；PACAP組CD3+CD8+T細胞比例低于D-Gal組；PACAP-PTD組CD3+CD8+T細胞比例高于D-Gal組。見圖8。

圖6 Real-time PCR 擴增結果

圖7 Real-time PCR檢測基因LMO2、Foxn1及IL-7的表達結果

與D-Gal組比較：**P<0.01；與PACAP組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4.2流式細胞儀檢測全血中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值結果 與D-Gal組比較，PACAP組和PACAP-PTD組CD3+CD4+/CD3+CD8+比值均上調(F=13.88，P<0.01)。而PACAP組和PACAP-PTD組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖 9。

圖8 CD3、CD4、CD8 T細胞表型變化

A:D-Gal組CD3+CD4+T細胞含量；B:D-Gal組CD3+CD8+T細胞含量；C:PACAP組CD3+CD4+T細胞含量；D:PACAP組CD3+CD8+T細胞含量；E:PACAP-PTD組CD3+CD4+T細胞含量；F:PACAP-PTD組CD3+CD8+T細胞含量

圖9 流式細胞儀檢測全血中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值

3 討論

胸腺作為機體重要的中樞免疫器官，是T淋巴細胞分化、發育、成熟和輸出至外周T淋巴細胞庫的場所，因此初始T細胞的數目可以評價胸腺T淋巴細胞生成和輸出功能。而sjTREC是在TCRα基因重組過程中，在TCRδ基因兩側的刪除片段δRec和ψJα之間重組形成一個環狀DNA分子而被刪除，其含量在胸腺組織近期產生的T淋巴細胞群體中最高，在細胞中穩定存在且不隨細胞分裂而復制，能夠代表形成功能性TCR時初始T細胞的數量。因此，檢測sjTRECs的含量能真實的評價胸腺的輸出功能狀態，現已成為基礎和臨床研究中重要的胸腺功能免疫學指標[6]。D-Gal誘導的衰老模型是目前較經典的衰老動物模型，接近于自然衰老規律[7]。本研究成功建立D-Gal致免疫衰老小鼠模型，胸腺功能發生破壞性降低。本研究中,PACAP組和PACAP-PTD組小鼠胸腺和脾臟的初始T細胞的數量較D-Gal組均增加，表明胸腺的生成和輸出功能均提高,向外周T淋巴細胞輸出增多，維持外周T細胞受體庫多樣性。證實PACAP和PACAP-PTD可以保護胸腺器官的功能性，恢復退化的胸腺功能，延緩胸腺相關的免疫衰老。同時，PACAP-PTD較PACAP對胸腺初始T細胞生成和輸出能力更有效。

胸腺退化是機體衰老的重要生物學標志，過程涉及復雜的基因表達變化。胸腺的各種功能主要是由胸腺微環境調節和顯現的。胸腺微環境主要由胸腺細胞和胸腺上皮細胞組成，并為細胞發育提供關鍵的細胞因子同時還可能對胸腺選擇有著調控與支持的作用。LMO2是一種T細胞原癌基因，蛋白質的過度高水平表達會導致T淋巴細胞過度增殖[8]。IL-7是胸腺早期維持T細胞的生長因子，確保胸腺T細胞增加輸出到外周庫，延緩胸腺萎縮和增強免疫反應[9]。Foxn1轉錄因子是調節胸腺上皮細胞發育的主要因子，其低表達會促進胸腺萎縮和免疫缺陷[10]。因此選擇以上幾個胸腺微環境相關的基因進行分析，進而有效的評價小鼠胸腺的狀態和功能。本研究中，PACAP組和PACAP-PTD組小鼠Foxn1基因上調，表明小鼠胸腺微環境中的胸腺上皮細胞活性和功能增強，胸腺微環境受到保護；IL-7基因上調可維持胸腺功能性和穩定狀態，保護胸腺微環境，增加外周T細胞的輸出；而其負調控因子基因LMO2表達下調，表示胸腺細胞在發育過程當中受負調控影響下降，胸腺細胞可正常發育。證實PACAP和PACAP-PTD可以使退化的胸腺功能得以回復，扭轉胸腺萎縮，延長細胞免疫功能。

胸腺經過對T細胞的馴化、選擇建立機體自身免疫耐受和維持免疫自穩。而T細胞亞群首要有CD3+CD4+的輔助性T細胞和CD3+CD8+的細胞毒性T細胞等，CD4+T細胞是協調B細胞產生抗體；CD8+T細胞則是抑制抗體合成、分泌及T淋巴細胞的增殖，它們的穩態維持機體日常的免疫應答。T細胞亞群可反映機體細胞免疫的水平，是目前臨床上較常用的反映免疫功能狀態的指標[11]。本研究中PACAP組和PACAP-PTD組小鼠全血中CD3+CD4+T細胞比例升高，表明調控免疫反應最重要的樞紐細胞增多；CD3+CD8+T細胞比例降低，表明免疫反應中直接殺傷性細胞減少；CD3+CD4+/CD3+CD8+比值反映機體T細胞亞群的狀態，比值升高表明機體T淋巴細胞免疫功能增加。證實PACAP和PACAP-PTD具有調節機體免疫功能，維持免疫平衡的作用。

總之，本研究以D-Gal致免疫衰老小鼠為模型，探討PACAP和PACAP-PTD通過延緩模型小鼠胸腺的萎縮,調節機體細胞免疫功能而發揮延緩衰老和免疫保護的作用。其中，PACAP和PACAP-PTD改變了退化的胸腺功能狀態與微環境，從多個指標的檢測中體現了其延緩衰老和調節細胞免疫功能作用。因此，闡明PACAP和PACAP-PTD延緩衰老小鼠胸腺萎縮的作用機制可望成為相關免疫衰老疾病的治療或輔助治療藥物。