CGRP對人牙周膜干細胞成骨分化和成血管能力影響的體外研究

王 芳，李漢青，何家才

頜骨缺損修復的傳統骨替代材料如自體骨、異體骨等，在臨床應用中存在不可忽視的局限性[1]。骨組織工程因具有骨再生能力、無免疫源性、創傷小的優勢，應用前景廣泛，但血管化問題限制了其臨床應用于大體積頜骨缺損的修復，因此具有促進骨再生和血管形成的雙重調控因子逐漸成為研究熱點[2-3]。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene- related peptide，CGRP)是神經肽類物質，體內含量豐富且生物學效應廣泛，血管擴張作用顯著[4]。同時近年CGRP在調控骨折愈合、骨重塑中的重要作用引起了關注[5-6]。因此，CGRP有望成為組織工程骨中具有促進骨再生和血管形成的雙重調控因子，但CGRP對間充質干細胞成骨成血管能力影響的研究尚未深入。鑒于此，該實驗體外運用CGRP探討其對人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化和成血管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器胎牛血清(以色列Biolnd公司)；胰酶消化液、DMEM培養基(美國Gibco公司)； PBS緩沖劑 (美國Solarbio公司)；CGRP(美國Sigma公司)；CCK-8試劑(日本同仁公司)；CO2恒溫孵箱(美國 Thermo公司)；茜素紅(美國Sigma公司)；BCIP/ NBT堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司) ；OCN、VEGF、RUNX2兔單克隆抗體(美國Abcam公司)；PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；實時熒光定量 PCR儀(美國Stratagene公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；酶標儀(美國Bio-tek公司)；流式細胞儀(美國 Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1hPDLSCs體外分離培養 于臨床收集牙周健康且無齲壞因正畸需要而拔除的前磨牙，超凈臺內，離體牙用含3倍雙抗的PBS沖洗。使用手術刀片從牙根表面的中1/3輕輕刮取牙周膜組織(避免根尖組織和牙齦混入)，盡量剪碎，以合適的密度鋪在6孔板皿底，加入適量含20%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液，避免晃動培養板，37 ℃、5%CO2條件下培養。每3 d左右換液，鏡下觀察當細胞生長達皿底60%左右時，用胰酶消化傳代。

1.2.2流式細胞術檢測hPDLSCs表型 取第2～3代hPDLSCs，消化后PBS洗滌2遍，使細胞懸液密度為5×106/ml，并向每個EP管加入200 μl細胞懸液。分別使用空白對照、CD34、CD45、CD44、CD90、CD105、CD146抗體標記，避光孵育， PBS洗滌2遍，細胞篩過濾細胞團塊以防阻塞機器，上機檢測。

1.2.3CCK-8檢測CGRP對hPDLSCs增殖能力的影響 實驗組根據培養液中CGRP的濃度分別分為0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組、10-6mol/L組。取對數生長期的hPDLSCs，以4×103/孔接種于96孔板，次日分別加入不同濃度的CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)，培養1、2、3、4、5 d后，棄上清液，每孔加入90 μl標準培養基+10 μl的CCK-8液，孵育2 h在避光環境中，酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density,OD)值，每組設5個復孔。

1.2.4RT-PCR檢測 實驗分為5組分別為0 mol/L組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L組。將hPDLSCs均勻鋪于6孔板密度調整為1×105/孔，培養12 h，每孔分別加入含不同濃度CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的基礎培養基，培養3、7、14 d分別提取細胞總RNA，進行RT-PCR定量檢測分析成骨成血管相關基因堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、核心結合因子2(runt-relatedtranscription factor2，RUNX2)、骨鈣素(osteocalin，OCN)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物列表

1.2.5Western blot檢測 實驗分組同1.2.4。將hPDLSCs均勻鋪于6孔板密度為1×105/孔，培養12 h，每孔分別加入含不同濃度CGRP(0、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)的基礎培養基，培養第7、14天分別將各組細胞裂解、提取蛋白。Bradfort蛋白定量后進行凝膠電泳、PVDF膜轉膜，然后5% BSA封閉液封閉(室溫1 h)，分別加一抗β-actin(1 ∶ 1 000)、RUNX2、OCN(1 ∶ 500)， VEGF(1 ∶ 2 000)，4 ℃環境下過夜，加入相應二抗(1 ∶ 5 000)，孵育1 h，蛋白條帶滴加ECL顯色液，曝光成像。

1.2.6ALP染色 將hPDLSCs接種于12孔板密度為5×104/孔，12 h后更換為含不同濃度CGRP的成骨誘導分化培養基，培養7 d后One-Step TMNBT/BCIP溶液(PIERCE)染色，并拍照；hPDLSCs以4×103/孔的密度接種96孔板，培養方法同前，培養7 d后ALP檢測試劑盒處理，測量405 nm處OD值。

1.2.7茜素紅染色 hPDLSCs鋪板培養方法同ALP染色，培養21 d，2%茜素紅染液染色，觀察拍照；然后將10%氯化十六烷基吡啶加入已染色的各樣本孔中，待各孔結節完全溶解，取溶解液測562 nm處的OD值。

2 結果

2.1 hPDLSCs體外分離培養組織塊法分離和培養hPDLSCs，約5～8 d光鏡下可觀察到原代細胞從組織塊周圍遷移出，細胞多呈長梭形，快速生長后呈放射狀排列。傳代培養后，細胞貼壁牢固，狀態良好。見圖1。

2.2 hPDLSCs鑒定流式細胞術檢測結果顯示，hPDLSCs高表達間充質干細胞細胞表面標志抗原CD44、CD90、CD105、CD146，低表達造血細胞表面標志抗原CD34和CD45。見圖2。

2.3 CCK-8檢測CGRP對hPDLSCs增殖能力的影響培養1 d，各組間細胞OD值無顯著差異；培養2、3、4、5 d，與0 mol/L組相比，10-8mol/L組、10-9mol/L組細胞OD值明顯升高，差異有統計學意義(F=45.564、96.624、147.952、162.069，P<0.05)，10-7mol/L組、10-10mol/L組細胞OD值無明顯變化，10-6mol/L組細胞OD值明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。這表明一定濃度范圍的CGRP促進hPDLSCs的細胞增殖，10-6mol/L組的CGRP抑制hPDLSCs的細胞增殖。見表2。

2.4 RT-PCR檢測CGRP對hPDLSCs成骨相關基因(ALP、RUNX2、OCN)和成血管相關基因VEGF表達的影響檢測成骨相關基因(ALP、RUNX2、OCN)和成血管相關基因VEGF在第3、7、14天的相對表達水平。結果表明：一定濃度CGRP作用于hPDLSCs，與0 mol/L組比較，ALP的表達水平在第3、7、14天時不同程度升高(F=12.383、55.967、958.389，P<0.05);Runx2的表達水平在第7、14天升高(F=46,341、395.544，P<0.05)；14 d時OCN表達水平明顯增加(F=389.195，P<0.05)，差異有統計學意義。VEGF的表達水平在第3天增加,持續至第14天 (F=73.210、201.754、295.48，P<0.05)差異有統計學意義。見圖3。

圖1 hPDLSCs體外培養

A:原代培養10 d ×100; B:第二代hPDLSCs ×100;C:第二代hPDLSCs ×500

圖2 流式細胞術檢測細胞表面標志物

A:CD34；B:CD45；C:CD44；D:CD90；E:CD105；F:CD146

表2 CCK-8檢測不同時間和組別的細胞OD值

與0 mol/L組比較：*P<0.05

2.5 Western blot檢測RUNX2、OCN、VEGF蛋白水平的表達Western blot結果顯示:第7、14天，與0 mol/L組比較10-9mol/L組、10-8mol/L組RUNX2、OCN、 VEGF表達水平不同程度增加(P<0.05)差異有統計學意義。見圖4。

2.6 ALP染色及茜素紅染色成骨誘導培養7 d后的ALP染色結果表明:與0 mol/L組比較，10-10mol/L組、10-7mol/L組的ALP活性無明顯差異；10-9mol/L組、10-8mol/ L組的ALP活性明顯增高，半定量分析顯示分別為0 mol/L組的1.4倍和1.7倍(F=387.989，P<0.05);茜素紅染色結果顯示:成骨誘導培養21 d，10-10mol/L組、10-7mol/L組結節生成量與0 mol/L組比較無明顯差異；10-9mol/L組、10-8mol/L組鈣結節生成明顯，半定量分析結果顯示分別為0 mol/L組的1.5倍和1.8倍(F=306.593，P<0.05)，見圖5、6。ALP染色及茜素紅染色半定量分析中OD值，見表3。

3 討論

臨床上hPDLSCs通常取自正畸牙或阻生齒，獲取hPDLSCs時患者額外創傷較小。有研究[7-8]表明hPDLSCs具有多向分化潛能，如分化為成骨樣細胞、脂肪樣細胞、神經樣細胞等。研究[7]發現hPDLSCs在體外培養過程中，其增殖率明顯高于骨髓間充質干細胞和牙髓干細胞， 因此在組織再生研究中有廣闊的應用前景。本實驗采用組織貼壁法培養hPDLSCs，方法成熟且操作方便。流式細胞術檢測結果顯示hPDLSCs表面間充質干細胞細胞表面標志抗原CD44(99.82%)、CD90(98.75%)、CD105(99.75%)、CD146(68.98%)表達為陽性，造血細胞表面標志抗原CD34(0.10%)、CD45(0.13%)表達為陰性，表明分離培養的細胞符合間充質干細胞的特性，可用于后續實驗。

圖3 RT-PCR檢測成骨分化相關基因和VEGF基因表達

A:ALP；B:RUNX2；C: OCN；D:VEGF；與0 mol/L組比較：*P<0.05

表3 ALP染色和茜素紅染色半定量分析中的OD值

半定量分析0 mol/L10-10 mol/L10-9 mol/L10-8 mol/L10-7 mol/LALP染色1.105±0.0421.130±0.0361.570±0.009?1.867±0.032?1.189±0.020茜素紅染色0.863±0.0430.87±0.0281.289±0.036?1.530±0.057?0.832±0.028

與0 mol/L組比較：*P<0.05

圖4 Western blot 檢測RUNX2、OCN、VEGF蛋白水平的表達

A:蛋白條帶；B:RUNX2；C:OCN；D：VEGF；1：0 mol/L；2：10-10mol/L；3：10-9mol/L；4：10-8mol/L；5：10-7mol/L；與0 mol/L組比較：*P<0.05

圖5 ALP染色及茜素紅染色

圖6 ALP染色及茜素紅染色半定量分析

A：ALP染色半定量分析；B：茜素紅染色半定量分析；1：0 mol/L;2:10-10mol/L；3：10-9mol/L；4：10-8mol/L；5：10-7mol/L; 與0 mol/L組比較：*P<0.05

血管化對于修復大體積的頜骨缺損非常重要，它可以提供營養物來支持支架內的細胞并及時排出代謝物促進新骨形成[3]。VEGF是目前公認的最強的促血管形成的生長因子，可促進內皮細胞的增殖和分化并誘導新血管形成[9]。CCK-8結果表明濃度為10-8mol/L的CGRP顯著促進hPDLSCs增殖。RT-PCR和Western blot 檢測結果顯示一定濃度的CGRP使VEGF的基因和蛋白表達量上升，說明CGRP能促進hPDLSCs分泌VEGF，故推測CGRP可通過提高hPDLSCs成血管能力間接提高骨修復能力。

CGRP是骨組織中分布最廣泛的神經肽，被認為是骨骼的天然活化劑，其潛在的治療效果受到越來越多的關注[10]。體外實驗顯示CGRP特異性受體降鈣素受體樣受體存在于成骨細胞和破骨細胞上，CGRP可促進成骨細胞的分化和增殖[11]，抑制破骨細胞的發育[12]。Zhou et al[13]研究發現CGRP可通過激活Wnt信號轉導通路促進BMSC成骨分化。ALP是成骨分化過程中的標志物，轉錄因子RUNX2有著調節間充質干細胞向成骨前細胞的分化的作用，OCN在骨形成和骨轉換中都起著重要作用。因此ALP、RUNX2、OCN的表達水平的反映著hPDLSCs的成骨分化能力[14]。RT-PCR、Western blot檢測、ALP染色和茜素紅染色結果顯示，10-8mol/L濃度組的CGRP可顯著提高hPDLSCs成骨分化能力。