羅格列酮對(duì)細(xì)菌脂多糖所致急性腎損傷和炎性反應(yīng)的保護(hù)作用

魏 嘯，付 林，博慶麗，徐德祥，吳永貴

感染性休克和膿毒癥引起的多器官功能障礙綜合征是臨床患者面臨的常見問題。盡管抗感染治療已取得很大進(jìn)展，但膿毒癥死亡率依然很高[1]。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是由多種病因和病理機(jī)制所致以腎功能迅速下降為特征的常見臨床綜合征，流行病學(xué)研究[2]表明，AKI是臨床上的常見危重疾病，在臨床重癥監(jiān)護(hù)患者中死亡率高達(dá)70%，而46%～48% AKI由膿毒癥所致，細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所導(dǎo)致的膿毒癥是引起AKI的常見病因。實(shí)驗(yàn)研究[3-4]表明，小鼠腹腔注射LPS常用于構(gòu)建AKI動(dòng)物模型，膿毒癥并發(fā) AKI 時(shí)病情兇險(xiǎn)，病死率高。

過氧化物酶增殖體活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)屬核受體超家族，是配體依賴性核受體轉(zhuǎn)錄因子。羅格列酮(rosiglitazone, RSG)是人工合成的PPARγ配體，其通過激活PPARγ轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因而發(fā)揮作用[5]。近年有研究[6]表明，PPARγ具有抗感染作用，其配體RSG可抑制LPS所致胎盤炎性反應(yīng)，但RSG是否可減輕LPS所致腎臟炎癥和AKI目前并不清楚。現(xiàn)探究RSG對(duì)LPS所致AKI的保護(hù)作用并從抗感染作用探討其可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑32只7～8周齡SPF級(jí)ICR系雄鼠，體質(zhì)量為28～30 g，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0011，購于北京維通利華公司。RSG購于成都恒瑞制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H20030569)； LPS 購于美國Sigma公司(批號(hào)067M4035V)；RT試劑購于美國Promega公司(批號(hào)A3500)；PCR試劑購買于瑞士Roche公司(批號(hào)114180424)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(keratinocyte chemoattractant，KC)ELISA試劑盒均購于武漢華美生物有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備將32只雄鼠隨機(jī)均分成4組：Control組、RSG組、LPS組和RSG+LPS組。LPS組經(jīng)腹腔注射給予小鼠單劑量LPS (2 mg/kg)；RSG+LPS組于LPS注射前連續(xù)4 d經(jīng)口灌胃給予RSG (10 mg/kg)。LPS注射后6 h用異氟烷麻醉小鼠，取血并處死小鼠，留取血清和腎臟組織。

1.3 腎臟mRNA提取和RT-PCR稱取50 mg腎臟組織加到玻璃勻漿器中，加入1 ml TRIzol，冰上勻漿45次，勻漿液在4 ℃離心機(jī)8 190 r/min離心10 min。吸取800 μl上清液至新的EP管中，加入150 μl 氯仿溶液，劇烈振蕩后4 ℃離心機(jī)中繼續(xù)8 160 r/min離心15 min。吸取250 μl上清液到新的EP管并加入1 ml異丙醇，左右輕輕搖晃EP管直至出現(xiàn)白色顆粒物。9 160 r/min離心8 min后倒去上清液，加入75%乙醇，用加樣器吹散白色顆粒物；重復(fù)上述操作3次，通風(fēng)櫥中自然干燥，然后RNA定量。DNA酶消化完成后繼續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 腎臟總蛋白的提取與Western blot稱取50 mg腎臟組織到玻璃勻漿器中，加入0.5 ml RIPA裂解液，冰上勻漿40次，勻漿完成后倒入1.5 ml EP管中，在4 ℃離心機(jī) 9 160 r/min離心15 min，吸取上清液300 μl后用BCA法檢測(cè)腎臟蛋白濃度，加入Loading Buffer將所有樣品蛋白定至同一濃度。固定玻璃卡槽，灌入分離膠和濃縮膠，膠凝固后拔出梳子，加入相同體積的蛋白樣品。然后內(nèi)槽加滿電泳緩沖液開始電泳，待溴酚藍(lán)跑到底部，停止電泳開始轉(zhuǎn)膜，然后牛奶封閉，孵育p-NF-κB p65 (1 ∶ 2 000)和β-actin (1 ∶ 10 000)一抗，PVDF膜清洗結(jié)束后，繼續(xù)孵育羊抗兔和兔抗鼠二抗(1 ∶ 80 000)，檢測(cè)β-actin和NF-κB p65磷酸化水平。

1.5 ELISA將ELISA試劑盒從4 ℃冰箱拿出，室溫平衡30 min后待用。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)孔中按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，待測(cè)品孔中每孔加入100 μl待測(cè)樣品，留2個(gè)空白孔作為Control組，加入一抗工作液50 μl。用封口膜蓋住96孔板，將體系置于37 ℃恒溫箱中孵育2.5 h。加入300 μl洗滌液，振蕩2 min，甩凈洗滌液，用濾紙吸干多余的液體，重復(fù)洗滌4次。加入酶標(biāo)抗體工作液50 μl，繼續(xù)37 ℃孵育1.5 h。重復(fù)洗板后，每孔加入底物工作液100 μl，繼續(xù)37 ℃反應(yīng)30 min。每孔加入100 μl反應(yīng)終止液，混勻后在450 nm波長處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，重復(fù)檢測(cè)3次，5 min內(nèi)完成檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算KC和TNF-α的濃度。

1.6 腎臟組織學(xué)檢測(cè)取材結(jié)束后，取小鼠左腎置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋切片，切片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)。采用Xu et al[7]的方法評(píng)價(jià)腎臟組織損害程度。

2 結(jié)果

2.1 RSG預(yù)處理改善LPS所致腎臟病理學(xué)損傷與Control組相比，LPS注射后6 h小鼠腎臟重量和腎臟系數(shù)有升高趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理組織學(xué)結(jié)果顯示，LPS組小鼠腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生脫落，管狀結(jié)構(gòu)有輕微擴(kuò)張以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(t=-10.361，P<0.01，圖1 )。進(jìn)一步觀察顯示，RSG預(yù)處理減輕了小鼠急性腎損傷和炎性細(xì)胞浸潤(t=5.455，P<0.01，圖1)。

2.2 RSG預(yù)處理減輕LPS誘發(fā)血清促炎細(xì)胞因子和趨化因子的升高ELISA法檢測(cè)小鼠血清KC和TNF-α水平，研究結(jié)果提示，LPS處理上調(diào)小鼠血清趨化因子KC水平(2 612±58.62) pg/ml (t=-28.186，P<0.01，圖2A)，而RSG預(yù)處理減輕LPS誘發(fā)血清KC水平(1 265±48.33)pg/ml升高(t=-11.390，P<0.01，圖2A)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠血清促炎細(xì)胞因子TNF-α濃度(376±22.21)pg/ml升高(t=-61.653，P<0.01，圖2B)，而RSG預(yù)處理可有效降低LPS所致小鼠血清TNF-α水平(279±14.32 )pg/ml上調(diào)(t=-14.711，P<0.01，圖2B)。

2.3 RSG預(yù)處理減輕細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)腎臟趨化因子上調(diào)用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠腎臟趨化因子mRNA水平，研究結(jié)果表明，與Control組比較，LPS處理后6 h小鼠腎臟趨化因子KC(t=-98.731，P<0.01，圖3A)，Mip-2 (t=-27.701，P<0.01，圖3B)和Mcp-1(t=-34.061，P<0.01，圖3C) mRNA水平升高；RSG預(yù)處理可抑制LPS誘導(dǎo)小鼠腎臟KC(t=-12.633，P<0.05，圖3A)和Mcp-1 mRNA上調(diào)(t=-11.049，P<0.01，圖3C)。

圖1 小鼠腎臟組織病理變化 HE×400

A：小鼠腎臟HE染色；B：小鼠腎臟病理評(píng)分；a：Control組；b：RSG組；c：LPS組；d：RSG+LPS組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

2.4 RSG預(yù)處理減輕LPS誘導(dǎo)腎臟促炎因子上調(diào)用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠腎臟促炎因子mRNA水平。結(jié)果顯示，LPS處理后6 h小鼠腎臟促炎因子TNF-α (t=-12.491，P<0.01，圖4A)和IL-1β (t=-12.526，P<0.01，圖4 B) mRNA水平升高；RSG預(yù)處理可減輕LPS誘導(dǎo)小鼠腎臟TNF-α (t=-7.545，P<0.01，圖4 A)和IL-1β (t=-8.273，P<0.01，圖4 B) mRNA上調(diào)(圖4A、B)。如圖4C所示，LPS對(duì)小鼠腎臟IL-4 mRNA水平無影響。

圖2 小鼠血清中KC和TNF-α水平

A：KC; B：TNF-α；a：Control組；b：RSG組；c：LPS組；d：RSG+LPS組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 RSG預(yù)處理減輕LPS上調(diào)小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平用Western blot方法檢測(cè)小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平，研究結(jié)果顯示，LPS處理上調(diào)小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平(t=-11.970，P<0.01，圖5A、B)；RSG預(yù)處理減輕LPS上調(diào)小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平(t=-6.244，P<0.05，圖5A、B)。

圖3 小鼠腎臟組織中趨化因子mRNA水平

A：KC; B：Mip-2; C：Mcp-1；a：Control組；b：RSG組；c：LPS組；d：RSG+LPS組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖4 小鼠腎臟組織中促炎因子mRNA水平

A：TNF-α; B：IL-1β; C：IL-4；a：Control組；b：RSG組；c：LPS組；d：RSG+LPS組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖5 小鼠腎臟中NF-κB p65磷酸化水平

A：小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平; B：小鼠腎臟p-NF-κB p65條帶灰度分析；a：Control組；b：RSG組；c：LPS組；d：RSG+LPS組；與Control組比較：**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.01

3 討論

本課題探討了PPARγ激動(dòng)劑RSG對(duì)LPS所致小鼠AKI的保護(hù)效應(yīng)。本研究表明，LPS引起小鼠腎臟組織病理學(xué)形態(tài)發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞脫落并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，表明小鼠腎臟產(chǎn)生明顯病理學(xué)損傷。進(jìn)一步觀察顯示，RSG可有效減輕LPS所致小鼠腎臟病理學(xué)損害和炎性細(xì)胞浸潤。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPARγ激動(dòng)劑RSG對(duì)LPS所致小鼠AKI有明顯保護(hù)效應(yīng)。

越來越多的研究[8-9]表明，促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β)和趨化因子(如KC、MCP-1和MIP-2)部分參與LPS所致小鼠AKI過程。一方面，TNF-α通過激活TNF-α受體參與了LPS誘導(dǎo)的急性腎衰竭[10]；另一方面，缺血再灌注急性腎損傷早期腎臟和血清KC水平顯著升高[11]。本研究也顯示，LPS處理引起小鼠血清KC和TNF-α水平明顯升高；進(jìn)一步檢測(cè)表明，LPS上調(diào)小鼠腎臟趨化因子(KC, Mcp-1和Mip-2)和促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，RSG預(yù)處理明顯抑制LPS引起小鼠血清KC和TNF-α水平升高；RSG預(yù)處理明顯抑制LPS誘導(dǎo)小鼠腎臟趨化細(xì)胞因子(KC和Mcp-1)和促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)上調(diào)。上述結(jié)果提示RSG預(yù)處理可能通過其抗感染作用減輕LPS所致小鼠AKI。

RSG抑制LPS所致炎癥反應(yīng)并減輕小鼠AKI的作用機(jī)制還不明確。大量研究表明，NF-κB是重要炎癥信號(hào)并參與LPS所致炎癥反應(yīng)。NF-κB信號(hào)被激活后，NF-κB p65從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核并作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)下游炎癥因子。PPARγ屬Ⅱ型核受體，而RSG是人工合成PPARγ激動(dòng)劑。已有研究[6]表明，RSG預(yù)處理激活胎盤PPARγ并抑制LPS所致NF-κB p65激活及其下游炎癥因子上調(diào)。機(jī)制性研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，RSG預(yù)處理促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞PPARγ與NF-κB p65之間相互結(jié)合，阻止NF-κB p65由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核并抑制NF-κB下游促炎細(xì)胞因子上調(diào)；此外細(xì)胞免疫熒光共定位的結(jié)果也表明LPS與RSG共處理促進(jìn)了NF-κB p65 和 PPARγ在細(xì)胞核中的共定位[12]。因此本文推測(cè)，RSG預(yù)處理可能通過激活PPARγ，促進(jìn)腎臟PPARγ與NF-κB p65之間的相互作用，阻斷NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制其轉(zhuǎn)錄活性及其下游的炎癥反應(yīng)繼而保護(hù)LPS所致AKI。目前也有部分研究[14]表明，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮通過減少NF-κB p65乙酰化水平降低炎癥反應(yīng)減輕順鉑所致腎臟毒性。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本課題檢測(cè)小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS處理后小鼠腎臟NF-κB p65磷酸化水平明顯升高， RSG預(yù)處理可顯著抑制LPS所致NF-κB p65磷酸化。上述結(jié)果可部分解釋RSG預(yù)處理保護(hù)LPS所致AKI的作用機(jī)制。

本課題在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察了RSG預(yù)處理對(duì)LPS所致AKI的影響，但是本研究也存在一些不足之處。首先本實(shí)驗(yàn)僅僅觀察了RSG預(yù)處理減輕LPS所致AKI的影響，而沒有研究LPS注射后補(bǔ)充RSG對(duì)LPS所致AKI的影響；其次本課題僅在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察RSG預(yù)處理拮抗LPS激活NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)，而沒有在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討其保護(hù)機(jī)制。本課題組將在后續(xù)的研究中完善這些不足之處。

綜上所述，PPARγ激動(dòng)劑RSG減輕LPS所致小鼠急性腎損傷，其保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)。本課題提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明，PPARγ激動(dòng)劑RSG可作為潛在藥物用于預(yù)防和治療膿毒癥所致急性腎損傷。