炎癥和非炎癥環境下肝干細胞細胞學特性觀察

黃俊凱，王 艷，楊奉天，李 婉，陳向金，楊 柳，徐麗紅，3

肝干細胞起源于Hering管、小葉內膽管、膽管周圍肝細胞和“空”細胞。當持續、嚴重的打擊作用于肝臟而正常肝細胞增殖受阻，此時肝干細胞激活、增殖，并雙向分化為膽管上皮細胞和肝細胞以修復、重建肝臟結構和功能。既往文獻[1]提示，肝干細胞的異常分化或分化受阻的肝干細胞可能是腫瘤的起源細胞。肝再生過程中，非可控性炎癥環境可使肝細胞和非實質細胞之間的協調平衡受損，導致細胞的遺傳物質發生永久性變化，且其周圍基質將變成有利于癌癥發展的腫瘤微環境[2]，促進腫瘤的發生。該實驗旨在通過觀察炎癥環境及非炎癥環境中肝干細胞的細胞學特性及亞細胞結構，初步分析2種環境中肝干細胞的細胞學特性及亞細胞結構差異。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器2-乙酰氨基芴(2-AAF，批號：SLBT5333)、2.5%戊二醛固定液(批號：G5882)、聚乙二醇400(批號：MKBZ4937V)購于美國Sigma公司；四氯化碳(CCl4，分析純)購于天津永晟精細化工有限公司；玉米油為中糧集團產品；單克隆兔抗大鼠上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗體(ab213500)、多克隆兔抗大鼠CD133抗體(ab16518)購于美國abcam公司；多克隆小鼠抗大鼠OV6抗體(MAB2020)購于美國R&D公司；山羊抗兔二抗(批號：ZB-2301)、山羊抗小鼠二抗(批號：ZB-2305)購于北京中杉金橋生物技術有限公司；水合氯醛(分析純)購于天津福晨化學試劑廠。透射電子顯微鏡(型號：JEM-1230)購于日本JEOL公司。

1.2 肝卵圓細胞增殖模型的建立

1.2.1實驗動物 15只SPF級SD雄性大鼠，5周齡，體質量180～200 g，購于新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心[許可證號：SCXK(新)2016-0001]。大鼠按體質量編號，隨機分為對照組(n=5)、炎癥環境肝干細胞增殖模型組(n=5)、非炎癥環境肝干細胞增殖模型組(n=5)。于石河子大學醫學院動物實驗中心喂養，由實驗中心統一提供飼料。飼養環境由實驗室根據動物飼養標準條件控制。該實驗經石河子大學醫學院第一附屬醫院動物實驗倫理委員會審查，批準號：A2017-151-01。

1.2.2非炎癥環境肝干細胞增殖模型的建立 參照Chien et al[3]的研究建立非炎癥環境肝干細胞增殖模型。2-AAF溶于聚乙二醇，配制成10 g/L溶液，按20 mg/kg體質量灌胃大鼠，每天1次，連續5 d，第6天10%水合氯醛按3 ml/kg體質量腹腔注射麻醉大鼠，行2/3肝切除術(切除肝左外葉和肝中葉)，術后第2天繼續按原劑量2-AAF連續灌胃6 d，繼續正常喂養4 d，于術后第10天10%水合氯醛麻醉后開腹取大鼠肝臟，以備病理組織學及電鏡檢測。

1.2.3炎癥環境肝干細胞增殖模型的建立 參照Chen et al[4]的研究建立CCl4/2-AAF炎癥環境肝干細胞增殖模型。50% CCl4-玉米油溶液按3 ml/kg體質量背部皮下注射，每周2次，第5周開始予以20 mg/kg 2-AAF連續灌胃14 d，10%水合氯醛麻醉，開腹取大鼠肝臟，以備病理組織學及電鏡檢測。

1.2.4正常對照組大鼠 常規喂養4周后取大鼠肝臟備檢測。

1.3 病理組織學觀察

1.3.1HE染色 肝臟標本常規固定、石蠟包埋、切片、烘片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脫蠟、乙醇溶液(無水乙醇、90%、80%、70%)水化，蘇木精浸染5 min、伊紅浸染3 min，乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片鏡檢。

1.3.2免疫組化 肝臟標本常規固定、石蠟包埋、切片、烘片、脫蠟至水，微波及高壓鍋抗原修復，一抗(抗體濃度EpCAM：1 ∶ 100，CD133：1 ∶ 200，OV6：1 ∶ 100)4 ℃濕盒孵育過夜，滴加50 μl相應二抗(山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗)37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明后封片鏡檢。判定標準：細胞膜或細胞質染色呈棕褐色判定為陽性，染色陽性程度采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均吸光度(optical density, OD)值，每組分別隨機選擇6張200倍鏡下圖片分別測量各組EpCAM、CD133、OV6平均OD值。

1.4 電鏡檢測肝臟組織戊二醛固定20 min，制備大約5 mm×5 mm×1 mm的肝臟組織塊。于新疆醫科大學電鏡室，PBS漂洗10 min×3次，1%鋨酸固定1 h，PBS漂洗10 min×3次，依次用50%、70%、80%、90%、100%、100%丙酮梯度脫水，各濃度丙酮均脫水15 min，100%丙酮與包埋劑1 ∶ 1混合浸透1 h，100%丙酮與包埋劑1 ∶ 3混合浸透3 h，純包埋劑浸透12 h，包埋(聚合)38 ℃、12 h，包埋(聚合)45 ℃、12 h，包埋(聚合)65 ℃、12 h，常規修塊、半薄切片，甲苯安藍染色定位、超薄切片、鉛鈾電子染色，JEM-1230型透射電鏡觀察，電鏡電壓均為80 kV。隨機選擇6個1 200倍鏡下視野分別計數非炎癥環境肝干細胞增殖模型、炎癥環境肝干細胞增殖模型中異型肝干細胞數量。

2 結果

2.1 一般情況非炎癥環境肝干細胞增殖模型組大鼠2只行2/3肝切除術后第2天死亡，原因可能為術中止血效果不佳，實際獲得有效大鼠3只；對照組大鼠、炎癥環境肝干細胞增殖模型組大鼠均存活；最終實際獲得有效大鼠共13只。

2.2 肝臟大體組織學改變正常大鼠肝臟，結構完整，顏色紅潤，表面光滑，邊緣銳利(圖1A)。非炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠殘余肝臟(右外葉、乳頭葉、三角葉)增生明顯，呈暗紅色，表面未見結節，質軟(圖1B)，與正常大鼠肝臟外觀相似。炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠肝臟顏色蒼白，表面不光滑，質韌，呈肝纖維化形成期組織學改變(圖1C)。

2.3 顯微鏡下肝臟組織結構及細胞形態改變HE染色觀察，正常大鼠肝臟結構規整，肝細胞形態正常、排列整齊(圖2A)。非炎癥環境肝干細胞增殖模型的大鼠肝臟顯微結構與正常大鼠相似，無炎性細胞浸潤(圖2B)。炎癥環境肝干細胞增殖模型的大鼠肝臟顯微結構呈肝纖維化形成期改變，肝小葉結構受損，肝細胞排列紊亂，大量炎性細胞浸潤(圖2C)。

A：正常大鼠；B：非炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠；C：炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠

2.4肝干細胞標志物表達情況2種肝干細胞增殖模型的肝組織中均可于匯管區附近見OV6、EpCAM、CD133陽性細胞，體積約為正常肝細胞大小的1/4，核質比高(圖3)。對照組、非炎癥環境肝干細胞增殖模型組、炎癥環境肝干細胞增殖模型組EpCAM、CD133、OV6平均OD值兩兩比較差異有統計學意義(F=85.696，P<0.05；F=33.308，P<0.05；F=77.478，P<0.05)(表1)。

2.5 肝干細胞超微結構特征及改變透射電鏡觀察，非炎癥環境肝干細胞增殖模型及炎癥環境肝干細胞增殖模型的肝臟組織中均可見卵圓形、核質比高、約為正常成熟肝細胞1/4大小的細胞，電鏡表現符合肝干細胞的超微結構特點。同時，所見肝干細胞可大致分為3型，Ⅰ型：體積較小，約為5 μm，細胞核呈橢圓形，核質比高，細胞器少(圖4A、D、G)。Ⅱ型：較Ⅰ型體積大，直徑6～8 μm，見卵圓形細胞核，核質比高；細胞質較Ⅰ型豐富，但較膽管上皮細胞、肝細胞胞質仍少(圖4B、E、H)。Ⅲ型：9～11 μm，體積較Ⅰ型細胞明顯增大，胞質較多，與成熟肝細胞形態結構相似，可見細胞間緊密連接(圖4C、F、I)。

A：正常大鼠;B：非炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠;C：炎癥環境肝干細胞增殖模型大鼠

圖3 肝干細胞標志物表達情況 免疫組織化學染色 ×200

A、B、C：EpCAM、CD133、OV6正常對照；D、E、F：非炎癥環境肝干細胞增殖模型的肝組織EpCAM、CD133、OV6免疫染色；G、H、I：炎癥環境肝干細胞增殖模型的肝組織EpCAM、CD133、OV6免疫染色

表1 肝干細胞標志物免疫組化染色平均OD值分析

圖4 肝干細胞超微結構

A、B、C：非炎癥環境肝干細胞增殖模型中肝干細胞 ×12 000；D、E、F：炎癥環境肝干細胞增殖模型中肝干細胞 ×20 000；G、H、I：炎癥環境肝干細胞增殖模型中異型肝干細胞(G、H ×20 000，I×12 000)

炎癥環境中的部分肝干細胞存在較為明顯的細胞形態變異，細胞核及核仁異型性，細胞核邊緣不規則，有大量切跡，見核仁邊集現象，異染色質非均質化(圖4G、H、I)。炎癥環境中異型肝干細胞數量[(4.40±1.52)/個]較非炎癥環境中異型肝干細胞數量[(0.80±0.84)/個]多，差異有統計學意義(t=4.648，P<0.05)。

2.6 炎癥環境肝干細胞增殖模型中的膽管反應本次實驗意外發現在炎癥環境肝干細胞增殖模型的肝組織中可見EpCAM、OV6表達陽性的染色質較深染的肝干細胞參與了膽管的形成，同時，電鏡觀察發現由4個肝干細胞共同形成的管腔結構，有突起的微絨毛伸向管腔，相鄰細胞間形成鑲嵌連接和緊密連接，疑似新生膽管(圖5)。

3 討論

現肝干細胞增殖動物模型有2-AAF/部分肝切除模型、CCl4/2-AAF模型、CDE模型(膽堿缺乏-乙硫氨酸模型)、二氫三甲吡啶模型等，其中較為經典的有2-AAF/部分肝切除模型、CCl4/2-AAF模型。本研究中2-AAF/部分肝切除模型無炎細胞浸潤，CCl4/2-AAF模型大量炎細胞浸潤，同時2種模型的大鼠肝臟組織中均見EpCAM+、CD133+、OV6+且體積約為正常肝細胞1/4大小的肝干細胞，證實本研究成功構建了非炎癥環境和炎癥環境肝干細胞增殖模型。

肝干細胞細胞常見表面標志物有CK7、CK8、CK18、CD90、CD133、EpCAM、OV6等，其中EpCAM、OV6、CD133均常用于肝干細胞的篩選、鑒定。既往研究[5]提示OV6可促進腫瘤細胞的自我更新、提高腫瘤細胞的侵襲性和遠處轉移能力，EpCAM的表達可促進細胞增殖、遷移，并且EpCAM+的肝癌細胞具有更強的成瘤性和侵襲性[6]，CD133參與肝臟腫瘤干細胞的自我更新的調節、促進腫瘤干細胞增殖和遷移，并與腫瘤細胞的上皮-間質轉化、耐藥性及瘤體血管形成密切相關[7]。在炎癥環境和非炎癥環境中均存在EpCAM+、CD133+、OV6+的肝干細胞，且炎癥環境中OV6、CD133、EpCAM表達量均較非炎癥環境中表達量高，提示炎癥環境中的肝干細胞可能更具有轉化為肝臟腫瘤干細胞的潛能。

圖5 炎癥環境肝干細胞增殖模型中膽管反應

近年來，已有學者[8-9]提出微環境的異常變化會影響正常干細胞的細胞學行為，并誘導干細胞轉化為腫瘤干細胞，并指出干細胞的增殖、分化、歸巢等細胞學行為可能與亞細胞結構密切相關，細胞形態改變可能在亞細胞水平影響干細胞的功能和轉歸。細胞核通過細胞骨架與細胞外基質相連接，可使細胞產生適應性反應。當細胞核發生嚴重形態改變時，細胞仍可存活甚至增殖、分化[10]，且細胞核異型性持續存在[9]。本研究提示在炎癥環境中增殖的肝干細胞核異型性的發生較非炎癥環境中明顯增多，但與細胞凋亡、壞死的亞細胞結構改變不同，而與肝癌細胞電鏡下特征相符。此外，本次實驗的炎癥環境肝干細胞增殖模型中，肝干細胞參與了"膽管反應"，既往有研究[11]顯示參與膽管反應的肝干細胞惡性轉化和遷移是肝癌侵襲和轉移的基礎。結合既往文獻和本實驗結果可以合理推測炎癥環境中肝干細胞可能更具有轉化形成肝腫瘤干細胞的潛能。同時，本次實驗的炎癥環境肝干細胞增殖模型的時間終點為第6周，組織學顯示為肝纖維化形成早期，故認為炎癥環境比預想更早地影響肝干細胞的亞細胞結構，對炎癥環境中肝干細胞的亞細胞結構改變進行深入研究有助于肝干細胞腫瘤特性的早期識別。

目前，雖然靶點阻斷腫瘤細胞的信號傳導、抑制腫瘤血管生成等肝癌治療策略提高了原發性肝癌患者的生存率，但對于慢性肝損傷中原發性肝癌的發生和復發并沒有有效的抑制。結合干細胞亞細胞結構的研究成果和本研究結果，認為在早期炎癥環境中觀察EpCAM+、CD133+及OV6+肝干細胞的亞細胞結構改變可能有助于預測原發性肝癌的發生，以提前進行臨床干預，但這需要對炎癥環境中各時間點肝干細胞亞細胞結構的動態時相變化進行觀察、驗證。