Rac1和Cdc42對橫紋肌肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡的影響

商 浩，王 萍,2*，劉春霞，李 鋒,3

關鍵字 橫紋肌肉瘤；Rac1；Cdc42

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS)是兒童常見的軟組織肉瘤之一，約占所有小兒惡性腫瘤的4.5%，好發于頭部和頸部[1]。盡管腫瘤切除、放射療法和化療方案等綜合治療在RMS中廣泛應用，兒童患者5年生存率有所提高，但高危患兒的存活率仍然較低[2]。因此，探究參與RMS發病的基因，明確其在RMS中所發揮的作用，將為RMS的診斷以及治療提供新思路。

Rac1、Cdc42屬于小G蛋白超家族成員，參與多種細胞信號傳導，在維持細胞正常功能中起重要作用。近些年研究[3-5]顯示，Rac1、Cdc42在卵巢癌、胃癌、嗜鉻細胞瘤等腫瘤中異常表達，參與腫瘤的發生發展。但是，尚未見Rac1、Cdc42在RMS中的報道。該研究通過檢測Rac1、Cdc42在RMS細胞中的表達，并分析其對RMS細胞生物學特性的影響，為RMS的分子診斷和靶向治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 胚胎性RMS RD細胞系購自中國科學院細胞庫；腺泡狀RMS RH30細胞系購自上海復翔生物技術有限公司；正常骨骼肌HSKMC細胞系購自北納生物技術有限公司；Rac1和Cdc42過表達質粒以及空載質粒(empty vector,EV)購自上海吉凱基因化學技術有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Life technologies公司；Total RNA Kit I購自美國OMEGA公司；miScript Ⅱ RTKit和miScript SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司；anti- Rac1、anti- Cdc42和anti-β-actin購自美國Cytoskeleton,Inc公司；CCK-8試劑購自日本Dojindo公司；transwell小室購自美國Costar公司；Matrigel購自美國BD Biosciences公司；Annexin V-APC/PI Apoptosis Detection Kit購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.1.2主要儀器 倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；7500實時PCR系統購自美國Applied Biosystems公司；電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統和全自動酶標儀購自美國BIO-RAD公司；PAS型流式細胞儀購自德國PARTEC公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 3株細胞系均使用含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青-鏈霉素)的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2細胞轉染 將RD和RH30細胞消化、重懸，以4×105細胞/孔接種于含有2 ml 10% FBS-DMEM培養基的6孔細胞培養板中，待細胞密度達到60%～70%時，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。

1.2.3實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR) 使用Total RNA Kit Ⅰ從細胞中提取總RNA。使用miScript Ⅱ RTKit將總RNA反轉錄成cDNA。使用miScript SYBR Green PCR Kit在7500實時PCR系統中進行擴增。Rac1和Cdc42為目的基因，β-Actin為內參基因。實驗組和對照組表達差異以RQ值為準，表示實驗組中目的基因相對于對照組表達的差異倍數。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4Western blot 裂解細胞，提取蛋白。配置10% SDS-PAGE膠，每孔蛋白上樣15 μl，電泳分離，切取目的蛋白條帶電轉至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，一抗( anti-Rac1，1 ∶ 1 000；anti-Cdc42，1 ∶ 1 000；anti-β-actin，1 ∶ 2 000) 4 ℃孵育過夜，洗膜；對應二抗室溫孵育2 h，洗膜、顯色、曝光。

1.2.5細胞增殖 將轉染不同質粒的細胞以4.5×103細胞/孔接種于含有0.1 ml 10% FBS-DMEM培養基的96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后以0、24、48和72 h為時間節點向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，使用酶標儀測定在450 nm(OD 450)處的吸光度。

1.2.6細胞侵襲和遷移 利用transwell小室檢測細胞侵襲和遷移能力能力，將0.2 ml DMEM培養基重懸的2.5×104細胞接種于用Matrigel處理的transwell上室中，將0.6 ml 20% FBS-DMEM培養基加入transwell下室中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養48 h，取出小室，對侵襲到膜下的細胞固定、染色、拍照、計數。細胞遷移能力檢測基本與細胞侵襲能力檢測步驟相同，但無需將Matrigel加入上室中，且細胞加入后只需培養24 h。同時，通過劃痕實驗進一步檢測遷移。在12孔細胞培養板中進行細胞轉染，第2天使用無菌的10 μl槍頭在長滿細胞的孔板中劃十字交叉垂線兩條，PBS漂洗細胞3次，加2 ml DMEM培養基，分別以0、12和24 h為時間節點觀察并拍照。

1.2.7細胞凋亡 細胞轉染48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞成單細胞懸液(消化時間不宜過長，否則容易引起假陽性)，預冷的PBS漂洗細胞2次，收集(2～5)×105個細胞，按照Annexin V-APC/PI Apoptosis Detection Kit說明書使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2 結果

2.1 Rac1、Cdc42在RMS細胞中高表達在RMS細胞和正常骨骼肌細胞中分別檢測Rac1、Cdc42的表達，以確定Rac1、Cdc42在RMS中的潛在作用。結果如圖1 A、B所示，相對于HSKMC細胞系，在RD和RH30細胞系中Rac1、Cdc42 mRNA以及蛋白的表達水平明顯升高。

圖1 Rac1、Cdc42在RMS細胞中高表達

A：Rac1、Cdc42 mRNA表達水平；B：Rac1、Cdc42蛋白表達水平；與HSKMC細胞系比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 轉染后細胞中Rac1、Cdc42的mRNA以及蛋白表達在RD和RH30細胞系中分別轉染Rac1、Cdc42過表達質粒，提取總RNA以及總蛋白檢測轉染效率。結果如圖2A、B、C、D所示，與EV相比，轉染Rac1、Cdc42過表達質粒后Rac1、Cdc42 mRNA以及蛋白的表達水平顯著升高。

圖2 轉染后細胞中Rac1、Cdc42的mRNA以及蛋白表達

A：Rac1 mRNA表達水平；B：Rac1蛋白表達水平；C：Cdc42 mRNA表達水平；D：Cdc42蛋白表達水平；與EV比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 Rac1、Cdc42促進RMS細胞增殖為研究Rac1、Cdc42對RMS細胞增殖能力的影響，課題組在RD和RH30細胞系中分別轉染Rac1、Cdc42過表達質粒，使用CCK-8實驗檢測細胞的增殖能力。結果顯示，與EV相比，過表達Rac1、Cdc42后RMS細胞的增殖能力增強。見圖3A、B。

圖3 Rac1、Cdc42促進RMS細胞增殖

A：RD細胞系；B：RH30細胞系；與EV比較：*P<0.05，***P<0.001

2.4 Rac1、Cdc42促進RMS細胞侵襲和遷移為研究Rac1、Cdc42對RMS細胞侵襲和遷移能力的影響，課題組在RD和RH30細胞系中分別轉染Rac1、Cdc42過表達質粒，使用transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力。結果顯示，與EV相比，過表達Rac1、Cdc42后RMS細胞的侵襲(圖4A)和遷移(圖4B)能力增強。在此基礎上，進一步使用細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結果如圖4C、D所示，與EV相比，過表達Rac1、Cdc42后RMS細胞的遷移能力增強。

2.5 Rac1、Cdc42抑制RMS細胞凋亡為研究Rac1、Cdc42對RMS細胞凋亡的影響，課題組在RD和RH30細胞系中分別轉染Rac1、Cdc42過表達質粒，使用流式細胞術檢測細胞的凋亡。結果如圖5所示，與EV相比，過表達Rac1、Cdc42后RMS細胞的抗凋亡能力增強。

3 討論

Rac1全稱為Ras相關C3肉毒素底物1，其主要功能是通過啟動p21活化的PAK1、PAK2和PAK3調節肌動蛋白細胞骨架，通過絲裂原活化蛋白激酶促進細胞增殖，通過NF-κB途徑調節炎癥反應等[6-8]。Cdc42全稱為細胞分裂周期蛋白42，其可介導20多種下游分子活化，包括蛋白激酶、脂質激酶、支架蛋白等，從而參與一系列細胞功能調節，包括細胞極性、增殖、侵襲、遷移、肌動蛋白細胞骨架重塑等[9]。Rac1和Cdc42的活性主要受鳥嘌呤核苷酸交換因子、GTP酶活化蛋白和鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑調節，使其在與二磷酸鳥嘌呤核苷結合的非啟動狀態和與三磷酸鳥嘌呤核苷結合的啟動狀態間循環轉換，進而扮演了“分子開關”的角色[5]。

圖4 Rac1、Cdc42促進RMS細胞侵襲和遷移

A：侵襲實驗；B：遷移實驗；C：RD細胞系，劃痕實驗；D：RH30細胞系，劃痕實驗；與EV比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖5 Rac1、Cdc42抑制RMS細胞凋亡與EV比較：*P<0.05，**P<0.01

Rac1、Cdc42在腫瘤中同樣具有重要作用，其在多種腫瘤中啟動或過表達，參與多種細胞信號傳導，調節腫瘤細胞周期、侵襲、遷移、凋亡以及腫瘤新生血管生成等。本研究顯示，Rac1、Cdc42在正常骨骼肌細胞中低表達，而在RMS細胞中高表達。在此基礎上，課題組在RD和RH30細胞系中轉染Rac1、Cdc42過表達質粒，以驗證Rac1、Cdc42對RMS細胞功能學的影響。結果顯示，轉染Rac1、Cdc42過表達質粒后二者表達升高，且相對于空白對照組，RD和RH30細胞的增殖、侵襲、遷移以及抗凋亡能力增強，表明Rac1、Cdc42在RMS中可能發揮癌基因的作用。

近些年隨著研究的深入，人們意識到不應單純的把Rac1、Cdc42看成獨立的個體。雖然Rac1、Cdc42的具體作用機制不同，但約有70%的氨基酸序列相同[10]，且結構相似，上下游調控分子也常一樣，并在多種腫瘤中共同表達，參與腫瘤的發生發展，提示Rac1、Cdc42在參與腫瘤的發生發展過程中可能具有協同作用。研究[11]顯示，在移動的細胞中Rac1、Cdc42的定位不斷改變，其主要聚集于細胞運動方向的膜前端，當移動方向發生變化時，原部位的Rac1、Cdc42的表達量降低，表明二者可能與腫瘤細胞的轉移存在聯系。在腫瘤血管生成的研究[12]中證實，Rac1、Cdc42可通過增強p53蛋白泛素化，降低其穩定性，促進血管內皮生長因子的表達。同時，在骨和軟骨形成的研究[13]中，Rac1、Cdc42的共同缺失表型比單一缺失表型對骨和軟骨形成的影響更加明顯，表明Rac1、Cdc42在調節骨和軟骨形成過程中具有協同作用。本研究顯示，Rac1和Cdc42在RMS細胞中均高表達，且促進細胞的惡性生物學行為。以上研究為Rac1、Cdc42在腫瘤中可能具有協同作用提供了理論基礎。

RMS在治療上取得的重大進步，歸因于人們對腫瘤發病機制的深入研究。但危重患兒的5年生存率仍然較低，因此尋找新的診斷標志和治療靶點具有重要意義。本研究顯示，Rac1、Cdc42在RMS中高表達，并促進RMS細胞的增殖、侵襲、遷移以及抑制凋亡，說明Rac1、Cdc42在RMS中可能扮演癌基因的角色。這將為深入研究RMS的分子診斷及靶向治療提供一定的理論依據。