CBLC在各分型分期乳腺癌中的表達差異及預后分析

李緯瑋，肖 斌，陸景潤，鄧 淳，李林海，羅昭遜

近年我國乳腺癌發病率和死亡率急劇增加，2015年新發病例達26.86萬，死亡6.95萬[1]。目前，基于乳腺癌分型的精準診斷方法逐漸完善，但缺少有效且臨床反應良好的治療靶標。因此，尋找一種針對乳腺癌分型分期、具預后評估效能的靶標對于乳腺癌靶向藥物研發十分重要。Cbl Proto-Oncogene家族蛋白是一組RF泛素連接酶(E3 Ubiquitin Ligases，E3)，哺乳動物細胞中有3種CBL家族蛋白：CBL、CBLB和CBLC(別名CBL-3、CBL-SL和RNF57)。相關研究[2]表明，在肺腺癌細胞中CBLC與CBL競爭結合表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，并維持其激活狀態。目前CBL家族蛋白的研究集中于CBL及CBLB，針對CBLC的研究主要圍繞其在肺癌中的作用，其對乳腺癌的影響情況仍不清楚。該研究旨在闡明 CBLC在不同乳腺癌分型分期中的表達水平，對乳腺癌細胞的增殖遷移影響及臨床價值，為乳腺癌的診治及預后評估提供潛在生物學標志物，為研究CBLC的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象本研究所用數據下載自USCS Xena(https://xenabrowser.net)數據庫的TCGA數據集，包括基因表達譜矩陣，樣本臨床信息和生存信息。將下載的1 217例樣本分為2組：乳腺癌組織1 104例和癌旁組織113例；根據臨床信息中乳腺癌雌激素受體、孕酮受體及HER2 受體的免疫組化評分將具有完整組織分型信息的707個乳腺癌樣本分為4組，其中Luminal A型135例、Luminal B型424例、HER2+型37例、TNBC型111例；根據不同病理組織類型將乳腺癌樣本分為浸潤性導管癌882例、浸潤性小葉癌211例、髓樣癌8例、化生性癌9例、混合組織型癌39、黏液癌18例及其他組織類型乳腺癌47例。下載1 203例患者樣本有相關的臨床信息和基因表達信息用于預后性分析；從上海芯超生物購買貨號為HBrE-Duc060CS-03的30例乳腺癌患者腫瘤組織及其鄰近正常組織切片芯片；從南昌聚焦生物有限公司購買MCF7乳腺癌細胞、PCDH空載質粒及CBLC質粒。

1.2 主要試劑及儀器Transwell細胞培養小室(美國corning公司，3422型)；轉染試劑(法國PolyPlus-transfection公司)；DMEM培養基及胎牛血清(FBS) (以色列BI公司)；細胞計數片及細胞計數器(深圳BodBoge公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司，DMI3000B型)；全自動酶標儀 (美國Thermo Fisher Scientific公司，YSK370) 。

1.3 差異基因分析箱線圖展示不同分子類型、組織類型乳腺癌標本中CBLC基因的表達分布，通過t檢驗和wilcox秩和檢驗比較組間差異；柱狀圖展示不同分子類型、組織類型乳腺癌標本中CBLC基因的表達平均值，通過t檢驗和wilcox秩和檢驗比較組間差異；折線圖展示不同分級分期乳腺癌標本中CBLC基因的表達分布，通過單因素方差分析及TukeyHSD多重比較檢驗比較組間差異；利用Kaplan-Meier法分析CBLC的表達與乳腺癌患者預后的相關性，并進行log-rank檢驗。

1.4 免疫組化對30例乳腺癌患者腫瘤組織及其癌旁組織切片進行免疫組化染色，使用3D HISTECH公司的Pannoramic MIDI掃描儀獲得組織切片上所有的染色信息，用Pannoramic viewer軟件放大后觀察，并截取代表性圖片。再應用Quant center 中的densito quant軟件自動識別并進行染色評分判定。組織切片上所有的深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色為陰性。進而對每個組織點進行識別，分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(單位：像素)，根據陽性的百分比進行H-SCORE免疫組化評分，H-SCORE=∑(PI×1)=(弱陽性PI×1)+(中度陽性PI×2)+(強陽性PI×3)，式中PI表示陽性細胞數量占切片中所有細胞數量的百分數；I代表著色強度。散點圖展示每個切片的H-Score免疫組化評分。

1.5 細胞劃痕實驗在普通6孔板中鋪板80萬/孔共2孔MCF7乳腺癌細胞，待細胞融合率為70%左右，向其中一孔轉染2 μg PCDH空載質粒，向另一孔轉染2 μg CBLC質粒，未轉染質粒組為對照組，轉染質粒組為實驗組。之后進行細胞劃痕實驗：使用200 μl容量槍頭筆直分別在兩孔中劃痕，0 h及48 h拍攝同一劃痕位置。

1.6 Transwell細胞遷移實驗在普通6孔板中鋪板80萬/孔共2孔MCF7乳腺癌細胞，待細胞融合率為70%左右，向其中一孔轉染2 μg PCDH空載質粒，向另一孔轉染2 μg CBLC質粒，未轉染質粒組為對照組，轉染質粒組為實驗組。兩組分別消化，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，2%血清培養基重懸細胞，調整細胞濃度，于Transwell上室加入5×105個細胞，在下室中加入0.5 ml含血清的完全培養基；培養箱培養24 h (37 ℃, 5% CO2)。取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用無鈣的PBS洗2次，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3次。100及200倍顯微鏡下隨機6個視野觀察細胞，記數。

1.7 CCK-8細胞增殖實驗在普通6孔板中鋪板8×105個/孔，共2孔MCF7乳腺癌細胞，待細胞融合率為70%左右，向其中一孔轉染2 μg PCDH空載質粒，向另一孔轉染2 μg CBLC質粒，未轉染質粒組為對照組，轉染質粒組為實驗組。兩組分別消化，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，在96孔板各孔中配置100 μl，5 000個細胞。培養箱培養24 h(37 ℃,5% CO2)后，分別于24、48、72 h加入CCK-8試劑，并孵育相同時間后檢測吸光度(optical density,OD)值。共3次實驗，每次3個復孔，取平均值，折線圖顯示結果。

2 結果

2.1 CBLC蛋白在乳腺癌及其癌旁組織中的表達水平CBLC蛋白在乳腺癌及其癌旁組織中的表達量不同。CBLC在乳腺癌組織中的平均表達量為3.519 957±0.86，在癌旁組織的平均表達量為2.330 751±0.83，差異有統計學意義(P=2.31×10-20)。見圖1。

圖1 CBLC蛋白在乳腺癌及其癌旁組織中的表達箱線圖

箱線圖中從下至上分別為最小值、下四分位數(第25百分位數)、中位數(第50百分位數)、上四分位數(第75百分位數)以及最大值

2.2 CBLC蛋白在不同乳腺癌分子分型中的表達水平CBLC在不同乳腺癌分子分型中的表達量均高于其癌旁組織。其中，CBLC在Luminal A亞型(ER+或PR+，HER2-)(P=1.15×10-20)、Luminal B亞型(ER+或PR+，HER2+)(P=9.43×10-7)和TNBC亞型(ER-，PR-，HER2-)(P=8.20×10-7)中的表達量較癌旁組織升高顯著，在HER2+亞型(ER-，PR-，HER2+)(P=0.32)中的表達較癌旁組織升高不明顯；CBLC在Luminal A亞型中表達量為4種乳腺癌分子分型中最高，且與CBLC在其他3種乳腺癌分子分型中的表達量均存在顯著差異，P(Luminal A vs Luminal B)=9.10×10-4，P(Luminal A vs HER2)=2.56×10-3，P(Luminal A vs TNBC)=4.03×10-3；而CBLC在HER2+亞型中表達量較癌旁組織升高幅度最小。可見CBLC的表達水平與ER+、PR+、HER2-的表達狀態具有一定的相關性。見圖2、表1。

圖2 不同分子類型與正常組織中CBLC蛋白表達分布箱線圖

表1 不同分子類型與正常組織中CBLC蛋白表達平均值

分子類型CBLC蛋白表達平均值(FPKM)TNBC3.160 305 324±1.32HER22.630 062 208±1.69Luminal A3.554 734 282±0.99Luminal B3.123 245 739±1.30癌旁組織2.330 750 653±1.18

2.3 CBLC蛋白在乳腺癌不同病理組織類型中的表達水平在5種乳腺癌病理組織分型中，CBLC蛋白在黏液癌中表達量最高，其次是浸潤性小葉癌，在混合組織類型癌中的表達量最低。除浸潤性小葉癌與黏液癌、浸潤性導管癌與其他類型乳腺癌之間表達差異性不顯著外，其他病理組織類型之間均具有顯著的表達差異，P(ILC vs IDC)=4.6×10-9，P(MH vs IDC)=0.11，P(MC vs IDC)=8.2×10-3，P(ILC vs MH)=3.6×10-5，P(ILC vs Other)=2.7×10-2，P(MH vs MC)=1.9×10-3，P(Other vs MH)=8.1×10-2，P(Other vs MC)=0.059。見圖3、表2。

2.4 CBLC表達與乳腺癌TNM及病理分期的相關性分析CBLC與TNM分期及乳腺癌臨床分期的相關性不大，其表達量在乳腺癌各分級分期中變化較大，趨勢不一致。僅在stage Ⅰ和stage Ⅱ兩個時期中表達變化差異顯著，其中stage Ⅰ包括ⅠA期(T1N0M0)及ⅠB期(T0N1miM0或T1N1miM0)，stage Ⅱ包括ⅡA期(T0N1M0或T1N1M0或T2N0M0)及ⅡB期(T2N1M0或T3N0M0)，CBLC基因表達變化與stage Ⅰ至stage Ⅱ病理分期相關(P=0.049 4)。見圖4。

表2 不同病理組織類型組織標本中CBLC蛋白表達平均值

2.5 CBLC表達與乳腺癌患者生存曲線分析分別以平均數或中位數為閾值將乳腺癌樣本劃分為CBLC高表達組與CBLC低表達組，結果均顯示CBLC高表達的患者預后生存率高于低表達的患者，這一差異在以平均數為閾值的分析中更為顯著(P=0.054)。見圖5。

圖3 不同病理組織類型組織標本中CBLC蛋白表達分布箱線圖

圖4 不同分級、分期乳腺癌的CBLC蛋白在乳腺癌不同TNM分期中的表達水平

圖5 CBLC基因相關的乳腺癌患者生存曲線圖

圖6 30例腫瘤組織及其鄰近正常組織的CBLC表達量免疫組化結果

A：代表性病例腫瘤組織及其鄰近正常組織的染色結果 SP×400；B：腫瘤組織及鄰近正常組織CBLC的H-Score散點圖

2.6 CBLC表達水平的免疫組化評分選取30例乳腺癌患者腫瘤組織及其癌旁組織切片進行免疫組化實驗，染色結果顯示CBLC在乳腺癌組織中的表達量顯著高于正常組(P=0.014)。每一組腫瘤組織中CBLC免疫組化H-Score評分均高于其對應的癌旁正常組織，且CBLC表達量在腫瘤組織中的分布較為集中，差異較小。見圖6。

2.7 CBLC過表達的MCF7乳腺癌細胞表型實驗在MCF7乳腺癌細胞中分別轉染CBLC質粒或空載PCDH質粒進行細胞劃痕實驗，結果表明：CBLC蛋白過表達的MCF7乳腺癌細胞48 h后劃痕愈合度顯著低于PCDH組，見圖7；Transwell遷移實驗(P=0.04)及CCK-8細胞增殖實驗(P=0.003)表明CBLC過表達能夠明顯抑制細胞增殖遷移，見圖8、9。

圖7 CBLC蛋白刺激下MCF7乳腺癌細胞的劃痕實驗 ×100

3 討論

乳腺癌是危害女性生命健康的主要惡性腫瘤之一，雖然在診斷和治療方面已經取得了較大進步，但診療現狀仍難令人滿意。乳腺癌是一種高度異質性惡性腫瘤，不同分子亞型及病理類型在基因特征、治療敏感性和預后等方面存在差異[3]。因此依據分子分型和病理分型尋找可靠的生物學標志物，對臨床的個體化治療非常重要。

圖8 CBLC蛋白刺激下MCF7乳腺癌細胞的Transwell遷移實驗

A：6個視野CBLC蛋白過表達或PCDH空載MCF7 Transwell細胞數散點圖；B：CBLC蛋白過表達或PCDH空載MCF7 Transwell遷移情況

CBLC參與負調控多種RTKs(如EGFR、MET和RET)及非受體依賴性酪氨酸激酶(如Src)，通過其上下游調控機制在乳腺癌的發生、發展、治療及預后中發揮重要作用[4]。

圖9 CBLC蛋白刺激下MCF7乳腺癌細胞的CCK-8增殖實驗

本研究顯示，CBLC在乳腺癌組織中的表達量高于癌旁組織。相關原因可能為，CBLC的編碼基因位于染色體19q13.32上，靠近卵巢癌，乳腺癌等惡性腫瘤的常見染色體高擴增區19q13.1。乳腺癌是位于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，而CBLC僅表達于乳腺上皮細胞而不表達于乳腺脂肪細胞[5]。

本研究結果顯示在所述4種亞型中，CBLC在Luminal A型中表達量最高。有學者研究[6]認為Luminal A型預后好，多屬于早期。本研究結果顯示CBLC在不同分子分型中表達量的高低排序與Onitilo et al[7]研究顯示的5年無病生存率LuminalA> LuminalB> Basal-like> HER2的排序一致。

本研究顯示CBLC在不同乳腺癌組織病理分類中的表達量由高到低為黏液癌>浸潤性小葉癌>浸潤性導管癌>混合類型癌。黏液腺癌屬于浸潤性特殊癌，分化程度較高，預后尚好。浸潤性非特殊癌包括浸潤性小葉癌、浸潤性導管癌，一般分化較低，預后較上述類型差。其他罕見乳腺癌發展迅速，預后最差。

CBLC在Luminal A型(ER+或PR+，HER2-)中表達量較癌旁組織升高幅度為4種亞型中最大，在HER2+型 (ER-，PR-，HER2+)中最小。曹穎 等[8]的免疫組化結果顯示其所用的黏液癌組織標本ER和(或)PR均陽性，HER2均陰性。可見CBLC的高表達可能與ER、PR受體呈正相關，與HER2受體呈負相關。有研究[9]證實ER、PR表達陽性的乳腺癌細胞惡性程度更低且細胞分化程度更高；而HER2過表達常提示腫瘤惡性程度高、預后差，在乳腺癌中被認為是僅次于淋巴結狀況的乳腺癌獨立預后指標。這也證明CBLC同時高表達于預后較好的Luminal A型(ER+或PR+，HER2-)及黏液癌型乳腺癌可能與ER、PR、HER2的表達相關。提示CBLC在乳腺癌病理生理過程中發揮了重要作用，可能與乳腺癌發生發展進程密切相關。

本研究表明，CBLC高表達抑制了MCF7乳腺癌細胞的增殖遷移且CBLC高表達患者預后生存率高于低表達患者，這與Stephen et al[4]針對CBLC表達量與乳腺癌患者KM生存曲線分析結果趨勢一致。其原因可能是CBLC能夠與受體酪氨酸激酶(rearranged during transfection proto-oncogene,RET)結合，并促進RET的泛素化和降解，從而抑制RET介導的下游ERK激活。雖然CBLC在乳腺癌發生發展中的作用報道較少，但CBLC在其他腫瘤中的生物學功能可供參考。有文獻[10]報道c-Src是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，能夠激活許多信號蛋白并導致轉化，促進腫瘤細胞增殖及侵襲遷移，與腎癌轉移密切相關。CBLC通過降解泛素依賴蛋白，可抑制c-Src誘導的轉化[11]。乳腺癌中CBLC可能通過類似機制發揮作用。

綜上所述，CBLC在乳腺癌各分型分期中的表達具有顯著性差異，其在惡性程度低(LuminalA型)、分化程度高(黏液癌)及早期乳腺癌(stage Ⅰ)中均高表達，并在乳腺癌stage Ⅰ期至stage Ⅱ期中表達量呈下降趨勢，與乳腺癌進程負相關，其高表達與乳腺癌患者預后良好正相關。因此，CBLC可能是新的乳腺癌分子診斷或靶向治療的潛在靶標，但具體的作用機制還需全面并大樣本地深入研究。