TRPV1基因多態性與新疆漢族、哈薩克族兒童哮喘相關性研究

付朋鴿，尹曉文

哮喘是一種較常見的呼吸系統疾病，我國城區0～14歲兒童哮喘總患病率為3.02%[1]，89.66%的兒童哮喘第1次喘息發生在7歲以內[2]。該疾病易常年反復發作，嚴重影響患兒心身健康及生長發育，也對家庭及社會造成一定的經濟負擔。

哮喘是感染、環境及遺傳等因素共同作用造成。個體呼吸道易感性可能與遺傳有關。在以色列國家對13～14歲學齡兒童進行全國調查，發現與阿拉伯兒童相比，猶太兒童哮喘患病率顯著升高[3]，提示哮喘在不同種族之間可能存在一定差異。瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potentia1 vanilloid，TRPV1)基因與呼吸系統疾病易感性的關系正處于研究階段。研究[4]表明，北京地區高表達TRPV1兒童患哮喘的危險性是低表達兒童的1.80 倍；Cantero-Recasens et al[5]研究稱TRPV1-I585V(rs8065080)變異基因攜帶者患哮喘風險較低。該研究旨在探討TRPV1基因的rs150846、rs8065080位點單核苷酸多態性(SNPs)與新疆地區漢族、哈薩克族兒童哮喘關系，以了解新疆哈薩克族兒童哮喘的遺傳易感性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2016年9月～2019年3月在新疆伊犁哈薩克自治州尼勒克縣人民醫院、石河子大學醫學院第一附屬醫院、新疆維吾爾自治區人民醫院兒科住院及門診就診的哮喘患兒99例，納入病例組。另選取同期在這幾家醫院進行體檢兒童77例作為對照組。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準通過，征得受試兒童家長同意。

1.2 研究方法

1.2.1納入標準及排除標準 病例組符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]有關標準。排除標準：① 患有喉軟骨發育不良、支氣管肺發育不良、支氣管異物等的兒童；② 患有先天性心臟病及其他先天畸形的兒童；③ 早產兒、足月小樣兒、免疫缺陷兒童。對照組既往無哮喘病史的健康兒童。排除標準：① 患濕疹、過敏性鼻炎、長期腹瀉等變應性疾病兒童；② 先天性心臟病及其他先天性畸形兒童；③ 合并其他嚴重內外科疾病的兒童。

1.2.2DNA的提取 抽取所有受試兒童的外周靜脈血2 ml，置于含2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的一次性采血管中，并放置于-80 ℃冰箱中保存備用；常溫解凍后，采用北京TIANGEN生化科技公司提供的離心柱型血液基因DNA提取試劑盒提取DNA，于-20 ℃冰箱保存備用。采用紫外分光光度計對DNA濃度及純度進行檢測，記錄DNA濃度及OD260/OD280值。DNA 樣本取1 μl，1%瓊脂糖凝膠電泳對其進行質量檢測，觀察DNA條帶熒光強度，判斷DNA 濃度及純度是否符合后續試驗要求。見圖1。

1.2.3rs8065080、rs150846位點多態性檢測 采用Massarray SNP分型技術進行兩位點多態性檢測。① 引物設計與合成rs8065080位點引物序列：上游5′-ACGTTGGATGGACCAAGCTCATTACCTGTG-3′，下游5′-ACGTTGGATGATGATCCTGAGAGACCTG-TG-3′；rs150846位點引物序列：上游5′-ACGTTGGATGATGTAACAGGGACAGTGGAG-3′，下游5′-ACGTTGGATGGGAGTAGGAGGGTGACTTTC-3′；由北京華大基因公司合成。② PCR擴增反應：反應體系包含：1.850 μl滅菌HPLC級水，0.625 μl 1.25×PCR Buffer，0.325 μl MgCl2, 0.1 μl dNTP Mix, 1 μl Primer Mix，0.5 U HotStar Taq，1 μl DNA樣本。PCR擴增條件：預變性94 ℃、3 min，循環條件：94 ℃、20 s, 56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，45個循環后72 ℃延伸3 min，4 ℃保溫。③ 測序和分型結果：樣本經SAP處理、延伸反應、產物純化，進行芯片點樣及質譜檢測；使用MassARRAY Typer 4.0軟件獲取數據。

圖1 部分DNA樣本的凝膠電泳圖

1.3 統計學處理采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，偏態分布的計量資料用中位數(四分位間距)表示，組間比較用秩和檢驗。病例組和對照組基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗；以比值比(OR)及95%可信區間(95%CI)表示相對危險度。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般情況病例組共99例，男性57例、女性42例；哈薩克族52例,漢族47例，中位數年齡48(36～80)月。對照組共77例，男性43例、女性34例；哈薩克族39例,漢族38例，中位數年齡60(36～96)月。病例組及對照組兒童在性別構成比(χ2=0.053，P=0.818)、年齡(Z=-0.614，P=0.530)、民族分布(χ2=0.061，P=0.805)比較，差異均無統計學意義。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗對照組中rs150846位點(χ2=1.589、P=0.452)、rs8065080位點(χ2=1.695、P=0.428)均符合遺傳平衡定律。

2.3 TRPV1基因多態性頻率分布運用Massarray SNP分型方法檢測基因位點、部分分型結果散點圖，圖中2個純合子分型根據產物峰高分別在靠近橫、縱軸聚類，在二者之間單獨聚類的一組為雜合子。見圖2。病例組與對照組在rs150846位點的基因型及等位基因頻率分布比較差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組在rs8065080位點的基因型及等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

圖2 基因型質譜散點圖

表1 病例組與對照組TRPV1基因兩位點基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

2.4 不同民族TRPV1基因rs150846、rs8065080位點基因型及等位基因頻率分布比較哈薩克族病例組與對照組在rs150846位點的基因型及等位基因頻率分布比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；以G等位基因作為參照，A等位基因攜帶者發生哮喘的危險性為G等位基因攜帶者的1.941倍(95%CI:1.037～3.636)。哈薩克族病例組與對照組在rs8065080位點基因型及等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。漢族病例組與對照組在rs150846、rs8065080位點的基因型分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

TRPV1基因位于人類染色體17p13區域，是瞬時受體電位離子通道蛋白(transient receptor potentialion channel, TRP) 超家族V亞家族成員，由432個氨基酸組成，在很多組織及細胞中均有表達，如氣管平滑肌細胞、上皮細胞、內皮細胞以及T細胞等，它可調節CD4+的活性和炎癥細胞的特異性[7]。有學者[8]認為，TRPV1基因與各種細胞因子之間相互影響，從而引起機體免疫紊亂或外周致敏，最終導致哮喘發生。而有實驗[9]表明內毒素誘導的氣道炎癥的小鼠，在敲除了TRPV1基因以后，氣道炎癥和支氣管高反應性均增強。國外研究[10]顯示，TRPV1受體可能是慢性支氣管哮喘的潛在藥物靶點，它顯著減輕了慢性哮喘小鼠模型中的氣道高反應性、氣道炎癥和重塑。TRPV1的激動劑可導致咳嗽、支氣管收縮、氣道微血管滲漏、氣道高反應性及氣道分泌物增多[11]，由此推測該基因可能與哮喘的發生有關。從遺傳學角度出發，探討遺傳因素在兒童哮喘的作用，了解不同民族人群中TRPV1 基因多態性(SNP) 的分布，提示其影響哮喘發生的具體途徑和中間環節，為臨床診斷等提供理論依據。

表2 哈薩克族在rs150846、rs8065080位點基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

表3 漢族rs150846、rs8065080位點基因型頻率分布[n(%)]

目前不同地區、不同人群的TRPV1基因多態性與哮喘易感性研究結果不一致。Chen et al[12]研究表明TRPV1表達水平是誘發兒童哮喘的危險因素之一。王強 等[13]研究顯示TRPV1 基因多態性是影響北京地區兒童哮喘的重要遺傳因素；Zhang et al[14]認為TRPV1的mRNA水平和SNP位點都可能是兒童哮喘的預測因子。關于TRPV1基因多態性與新疆不同民族兒童哮喘相關性的研究尚罕見報道。rs8065080、rs150846兩位點均屬于TRPV1基因編碼區；rs150846 A/G突變屬于TRPV1基因編碼區的內含子突變。研究[15]顯示，該位點突變可能與無哮喘者發生夜間咳嗽的危險性增加有關(OR=1.22，95%CI:1.05～1.41)。而該研究表明在哈薩克族rs150846位點的基因型頻率AA、GG、GA及等位基因A、G比較，差異均有統計學意義，提示TRPV1基因的rs150846位點多態性可能與哈薩克族兒童哮喘易感性有關，A等位基因攜帶者可能增加患哮喘的風險；而在漢族病例組和對照組中基因型及等位基因頻率分布均無差異，這提示rs150846基因多態性與新疆地區兒童哮喘可能存在民族差異。rs8065080位于TRPV1基因的第15個外顯子，該基因位點的C/T突變在蛋白水平表現為纈氨酸突變為異亮氨酸。本研究表明該基因位點多態性與新疆漢族、哈薩克族兒童哮喘均無相關性，這與Cantero-Recasens et al[5]的研究不同，可能與不同地區人口分布、環境等因素均有關。

綜上所述，該研究對TRPV1基因rs150846、rs8065080位點單核苷酸多態性與新疆漢族、哈薩克族兒童哮喘的相關性進行探討，表明TRPV1基因的rs150846位點基因多態性與哈薩克族兒童哮喘易感性相關，與漢族兒童無關；而rs8065080位點基因多態性與漢族、哈薩克族兒童哮喘易感性無關。