ELISA檢測乙肝兩對半少見模式和弱陽性結(jié)果分析及報告單注釋策略

劉嘉清，李 濤，吳 憲，王蓮子，王慧慧，李雪梅，肖春紅，郝 麗，閆 川，盛大平，周 敏，徐勝前

乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)、乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B surface antibody, HBsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)、乙型肝炎病毒e抗體(hepatitis B e antibody, HBeAb)和乙型肝炎病毒核心抗體(hepatitis B core antibody, HBcAb)是判斷乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染和免疫狀態(tài)的主要血清學(xué)指標(biāo)，俗稱乙肝兩對半。 ELISA作為最常用的乙肝兩對半檢測方法，因手工步驟繁雜、靈敏度低而影響結(jié)果準(zhǔn)確性。解釋性注釋(interpreting commenting)[1]是指要求實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員以書面的形式為臨床醫(yī)師提供實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的說明與建議，而目前對于乙肝兩對半的罕見模式缺乏結(jié)果的判斷及報告單的解讀。

現(xiàn)分析ELISA檢測乙肝兩對半的少見模式和弱陽性結(jié)果，利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)對HBsAg進(jìn)行定量復(fù)查，希望為制定報告單注釋策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年7月～2019年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院部乙肝5項(xiàng)少見模式及弱陽性檢查結(jié)果175例，包括HBsAg弱陽性56例、HBsAg與HBsAb同時陽性58例、HBeAb與 HBcAb同時陽性或其中一項(xiàng)陽性61例。

按照吸光度(optical density, OD)值納入以下3組模式：① 表面抗原弱陽性模式：0.105≤ODHBsAg≤1且ODHBsAb<0.105；② 表面抗原與表面抗體同時陽性模式：ODHBsAg≥0.105且ODHBsAb≥0.105；③ e抗體與核心抗體同時陽性或其中一項(xiàng)陽性：ODHBsAg<0.105且ODHBsAb<0.105且ODHBeAg<0.105且ODHBeAb與ODHBcAb不可同時>0.5。

1.2 標(biāo)本采集與保存全部病例均清晨空腹采取靜脈血4 ml，充分凝固后經(jīng)4 000 r/min×5 min離心分離血清，2 h內(nèi)送檢。不能及時處理的標(biāo)本離心后于2～8 ℃保存且不超過1周。

1.3 試劑與儀器乙肝兩對半ELISA試劑盒購自中山生物工程有限公司；乙肝兩對半CLIA試劑盒購自意大利索林診斷公司；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試劑盒購自北京康徹思坦公司生物技術(shù)有限公司；煙臺艾德康A(chǔ)ddcare ELISA 1800全自動酶免分析儀；意大利DiaSorin LIAISON XL全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；合肥科大創(chuàng)新KDC-1044立式離心機(jī)。

1.4 結(jié)果復(fù)查所有標(biāo)本用LIAISON XL全自動CLIA分析儀進(jìn)行復(fù)查，以復(fù)查結(jié)果作為判定陰性或陽性的最終結(jié)果。

1.5 模式表示1、2、3、4、5分別代表HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。陽性結(jié)果以“+”表示，陰性結(jié)果以“-”表示或省去，特指弱陽性結(jié)果以“±”表示。如:HBsAg弱陽性、HBsAb陰性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、HBcAb陽性，其代碼稱1±3+5+模式。

1.6 質(zhì)量控制ELISA檢測每個反應(yīng)板同時設(shè)置空白對照、陰性對照、陽性對照以及弱陽性質(zhì)控, 空白對照、陰性對照和陽性對照由試劑盒自帶，弱陽性質(zhì)控購自北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司，濃度值分別為HBsAg：500 IU/L；HBsAb：10 IU/L；HBeAg：1 000 NCU/L；HBeAb：8 000 NCU/L；HBcAb：500 IU/L。空白對照、陰性對照、陽性對照以及弱陽性質(zhì)控OD值及精密度符合試劑盒說明書和《臨床定性免疫檢驗(yàn)重要常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》[2]。

CLIA質(zhì)控購自北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司，濃度值分別為HBsAg：1 000 IU/L，使用陰性血清稀釋為100 IU/L; HBsAb：10 IU/L；HBeAg：1 000 NCU/L；HBeAb：8 000 NCU/L；HBcAb：500 IU/L, 連續(xù)檢測20個工作日，每個工作日檢測1次，CV<10%。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測HBsAg弱陽性HBsAb陰性標(biāo)本

2.1.1HBsAg復(fù)查后陽性率分析ELISA檢測 HBsAg弱陽性結(jié)果可分為1±、1±4+、1±5+、1±4+5+四種模式，其中1±4+5+模式占比最高(60.7%)。1±、1±5+和1±4+5+模式HBsAg復(fù)查后陽性率分別為15.4%、50%和100%。1±4+5+模式的HBsAg陽性率高于1±模式(P<0.01)，其余模式間比較HBsAg陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.1.21±、1±5+與1±4+5+模式HBsAg OD值分析 1±模式與1±4+5+模式的HBsAg OD值均值分別為0.249和0.430，后者高于前者(P<0.01)，其余模式間HBsAg OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。1±4+模式樣本例數(shù)較少，未納入分析范圍。見圖1。

圖1 1±、1±5+與1±4+5+模式HBsAg OD值分布圖

1±：0.249±0.182；1±5+：0.327±0.159；1±4+5+：0.430±0.204

2.2 ELISA檢測HBsAg與HBsAb同時陽性標(biāo)本

2.2.1HBsAg與HBsAb復(fù)查后陽性率分析 ELISA檢測HBsAg與HBsAb同時陽性可分為1+2+、1+2+4+、1+2+5+、1+2+4+5+四種模式，其中1+2+4+5+模式占比最高(55.2%)。根據(jù)CLIA復(fù)查結(jié)果，HBsAg與HBsAb可分為3種類型：1+2+、1+2-與1-2+，無1-2-結(jié)果。見表2。

對例數(shù)較多的1+2+與1+2+4+5+模式進(jìn)行分析。1+2+4+5+模式的HBsAg CLIA陽性率高于1+2+模式(P<0.001)。見表3。1+2+模式的HBsAb CLIA陽性率高于1+2+4+5+模式(P<0.001)。見表4。1+2+4+5+模式CLIA復(fù)查后維持HBsAg與HBsAb雙陽性率高于1+2+模式(P<0.01)。見表5。

表1 56例ELISA檢測HBsAg弱陽性CLIA復(fù)查結(jié)果[%(n)]

與1±5+組比較:aP>0.05；與1±4+5+組比較:bP<0.01；與1±4+5+組比較:cP>0.05

表3 1+2+與1+2+4+5+模式HBsAg CLIA復(fù)查結(jié)果[%(n)]

表4 1+2+與1+2+4+5+模式HBsAb CLIA復(fù)查結(jié)果[%(n)]

表5 1+2+與1+2+4+5+模式CLIA復(fù)查HBsAg與HBsAb雙陽性結(jié)果[%(n)]

2.2.21+2+和1+2+4+5+模式HBsAg與HBsAb OD值分布及CLIA結(jié)果分析 按照0.105～<1、1～<2、≥2將HBsAg與HBsAb OD值分為低、中、高3區(qū)。ELISA結(jié)果1+2+模式中，標(biāo)本復(fù)查后95%為1-2+型，HBsAg對應(yīng)的OD值多處于0.105～<1區(qū)間內(nèi)，HBsAb OD值無分布特征。ELISA結(jié)果1+2+4+5+模式中，復(fù)查后仍為1+2+型，HBsAb OD值多數(shù)處于0.105～<1區(qū)間內(nèi)，HBsAg OD值無分布特征；復(fù)查后為1+2-型，43.75%的HBsAg OD值≥2.50%的HBsAb OD值處于0.105～<1區(qū)間內(nèi)。見表6。

2.3 ELISA檢測HBeAb與HBcAb同時陽性或其中一項(xiàng)陽性

2.3.1HBsAg復(fù)查后陽性率分析 4+、5+、4+5+三種模式的HBsAg復(fù)查陽性率分別為20%、10.8%、52.6%，其中4+5+模式的HBsAg陽性率高于5+模式(P<0.01)，其余模式間比較HBsAg陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

2.3.25+與4+5+模式HBsAg OD值分析 由圖2可見，5+模式 HBsAg OD值均<0.02；以O(shè)D值為0.02為界限將4+5+模式分為兩組，OD值≥0.02組復(fù)查后HBsAg陽性率為100%，高于OD值<0.02組(P<0.01)。4+模式樣本例數(shù)較少，未納入分析范圍。見表8。

3 討論

HBsAg作為HBV感染的主要病原標(biāo)志，對病情的診斷有較大意義。常規(guī)的ELISA檢測存在諸多局限性，且Hook效應(yīng)、溶血及黃疸等干擾因素可導(dǎo)致假陽性。CLIA法具有更高的靈敏度與特異性，且自動化程度高，常作為較準(zhǔn)確的復(fù)查手段，但對可疑結(jié)果實(shí)施大批量復(fù)檢的成本較高[3]。解釋性注釋要求在報告結(jié)果的同時，也應(yīng)說明該結(jié)果對疾病的診斷意義,對于初步結(jié)果應(yīng)給予排除或驗(yàn)證感染的方法[4]。由于專業(yè)的差異與檢驗(yàn)方法、試劑及機(jī)器的復(fù)雜性，檢驗(yàn)人員與臨床醫(yī)師對乙肝兩對半的ELISA結(jié)果的理解仍存在不完全對接的情況，一方面，臨床中常出現(xiàn)低水平的HBsAg漏檢[5-6]；另一方面，隨著病情的變化，除了常見的7種兩對半模式，仍存在20多種少見模式，因此檢驗(yàn)人員應(yīng)對ELISA結(jié)果進(jìn)行針對性的復(fù)查，并添加報告單注釋。

表6 ELISA 1+2+和1+2+4+5+模式HBsAg與HBsAb OD值分布及CLIA結(jié)果

表7 61例ELISA檢測HBeAb與HBcAb同時陽性或其中一項(xiàng)陽性CLIA復(fù)查結(jié)果[%(n)]

表8 19例4+5+模式HBsAg CLIA復(fù)查結(jié)果[%(n)]

圖2 4+5+模式與5+模式HBsAg OD值分布圖

5+：0.005±0.003；4+5+：0.021±0.028

本實(shí)驗(yàn)選取56例HBsAg OD值≤1的弱陽性標(biāo)本進(jìn)行分析，可見1±4+5+模式HBsAg復(fù)查后皆為陽性，其定量均值處于較低水平，而1±及1±5+模式皆存在HBsAg假陽性的情況。提示在雙抗體(HBeAb與HBcAb)皆為陽性的HBsAg弱陽性病例中，其HBsAg滴度較低，但仍提示“小三陽”。較低的HBsAg濃度可能與其低水平表達(dá)、HBV的整合及宿主等免疫因素有關(guān)[7-8]，對于正在接受治療的乙肝患者來說，意味著HBsAg正在進(jìn)行血清轉(zhuǎn)化，提示疾病轉(zhuǎn)歸較好，當(dāng)前治療有效；而對于長期感染乙肝病毒的患者，可提示其體內(nèi)病毒復(fù)制水平較低，傳染性較弱但已向慢性化轉(zhuǎn)變。因此，對于HBsAg弱陽性模式應(yīng)有以下化驗(yàn)單注釋：① 1±4+5+模式應(yīng)備注“HBsAg低水平表達(dá)，提示小三陽，建議臨床定期復(fù)查HBsAg”；② 其余模式應(yīng)備注“HBsAg陽性結(jié)果存疑，建議定量復(fù)查”。

當(dāng)人體感染HBV時，人體免疫系統(tǒng)會受到刺激從而產(chǎn)生特異性免疫球蛋白G即HBsAb，其與HBsAg進(jìn)行結(jié)合最終清除，因此被稱為保護(hù)性抗體。通常情況下，HBsAg與HBsAb不會同時出現(xiàn)，但檢驗(yàn)工作中確有發(fā)生[9]。本實(shí)驗(yàn)中，1+2+模式定量后主要為1-2+型，HBsAg OD值較小且復(fù)查后為陰性結(jié)果；而多數(shù)1+2+4+5+模式的病例可見其HBsAg復(fù)查后仍為陽性，且當(dāng)HBsAg OD值較高而HBsAb OD值較低時，HBsAb假陽性概率更大。這一部分雙陽性的出現(xiàn)可能是由于HBsAg或HBsAb處于臨界值，儀器的靈敏度較低從而造成誤判。HBsAg與HBsAb實(shí)際共存可存在以下原因：① HBsAg與HBsAb處于動態(tài)過程，偶見抗原抗體一過性并存的情況；② 不同亞型HBV重疊感染[10]；③ HBsAg S基因主要親水區(qū)的氨基酸變異產(chǎn)生免疫逃逸。本實(shí)驗(yàn)中，HBsAg與HBsAb同時陽性以“1245”模式為主，其HBsAb以低濃度10.00～<100.00 IU/L為主，與高衛(wèi)亞 等[11]報道一致，說明患者體內(nèi)產(chǎn)生的HBsAb無法中和HBsAg，因此該HBsAb對患者沒有保護(hù)作用，可能由于慢性乙肝患者病程較長，HBsAb對乙肝病毒的長期篩選壓力導(dǎo)致HBsAg發(fā)生免疫逃避突變。因此乙肝患者同時出現(xiàn)HBsAg與HBsAb不代表乙肝的恢復(fù)，而是提示該患者體內(nèi)有持續(xù)存在的HBV的突變與復(fù)制，造成肝功能的慢性損傷，因此應(yīng)加強(qiáng)對此類患者的隨訪。HBsAg及HBsAb雙陽性模式應(yīng)有以下化驗(yàn)單注釋：① 1+2+4+5+模式應(yīng)備注“HBsAb結(jié)果存疑，建議定量復(fù)查及加強(qiáng)患者隨訪”；② 1+2+模式應(yīng)備注“HBsAg結(jié)果存疑，建議定量復(fù)查及加強(qiáng)患者隨訪”。

單項(xiàng)HBcAb陽性提示HBV既往感染，較為常見，本實(shí)驗(yàn)中復(fù)查后多維持原模式，不建議再行定量復(fù)檢。HBeAb和HBcAb雙陽性常提示HBsAg漏檢，本實(shí)驗(yàn)中漏檢率為52.6%，與文獻(xiàn)報道中60%大致相符[12]。實(shí)驗(yàn)中，OD≥0.02的雙抗體陽性標(biāo)本HBsAg陽性率為100%。因此，基層醫(yī)院在ELISA檢測乙肝標(biāo)志物的工作中出現(xiàn)的HBeAb、HBcAb雙陽性標(biāo)本，應(yīng)當(dāng)警惕其是否存在HBsAg漏檢情況，應(yīng)根據(jù)HBsAg OD值給予化驗(yàn)單注釋：① HBsAg OD值≥0.02時，務(wù)必建議臨床予以復(fù)查，應(yīng)備注“HBsAg極大陽性可能，建議定量復(fù)查！”；② HBsAg OD值<0.02時，應(yīng)備注“HBsAg結(jié)果存疑，建議定量復(fù)查。”

綜上所述，ELISA檢測乙肝兩對半結(jié)果較為復(fù)雜，應(yīng)在報告單中添加必要的解釋以及對于后續(xù)處理的建議。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，HBsAg的OD值、兩對半的陽性模式、HBcAb和HBeAb的結(jié)果對判斷HBsAg是否陽性具有一定的指導(dǎo)意義，為ELISA檢測乙肝兩對半報告單進(jìn)行更有針對性的注釋策略提供了依據(jù)。