不同克隆耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的流行病學分析

左 燕, 趙冬梅，李家斌，王中新

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapnuemoniae, CRKP)在全球范圍內的廣泛傳播已成為嚴重的公共衛生威脅之一[1]。在中國，CRKP的患病率也從2005年的3.0%逐步上升到2016年的16.1%，且依然呈上升趨勢[2]。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥機制中最主要的是碳青霉烯酶的產生[3]。產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(klebsiellapnuemoniaecarbapenemase, KPC)型CRKP的流行及傳播已被廣泛報道，包括中國[4-5]，而多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)方法的出現更促進了其全球范圍內種群結構的評估，序列分型(suquence type, ST)258及其變體組成的克隆復合物 (clonal complex 258, CC258) 被報道介導CRKP的傳播，而ST11作為CC258家族中的一員則是中國CRKP傳播的主要原因[6]。過去已有很多針對CRKP感染臨床及微生物學特征的研究,但不同克隆是否存在特定的臨床及微生物學特征少有報道[7-9]。該研究對安徽省一家三級甲等醫院CRKP的ST11及非ST11兩組感染的臨床及微生物學特征進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 設計與定義本研究是對安徽省一家擁有2 800 張床位的三級甲等醫院2015～2016年間CRKP臨床感染菌株的一項回顧性調查。通過醫院的實驗室信息系統篩選CRKP分離株，CRKP被定義為對亞胺培南或美羅培南任何一種耐藥的肺炎克雷伯臨床分離株。且對于反復送檢陽性的，本研究僅納入第一例陽性分離株。感染的定義基于疾病控制和預防中心(CDC，美國)的指南[10]，主要結局指標是院內死亡率，次要結局是感染治療的結果，并且評估為有效(治愈或改善)或無效(穩定或惡化)。

1.2 菌株所有分離株儲存在-80 ℃的冰箱中，并通過基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜儀(BioMérieux, 法國)進行鑒定。CRKP感染株的藥敏試驗通過Vitek 2全自動微生物儀(BioMérieux，法國)及紙片擴散法完成，結果解讀參考CLSI 2016標準[11]。煮沸法提取菌株的DNA作為模板，PCR擴增碳青霉烯酶(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)和超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)基因(blaSHV、blaTEM、blaCTX-M)。 PCR擴增7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)，結果提交給eBurst軟件以確定菌株的序列分型。

1.3 數據收集通過醫院的電子病歷系統收集菌株感染患者的臨床資料，主要包括：人口統計學、感染前特殊治療(僅限住院期間菌株分離之前者)、基礎疾病、感染前抗生素的使用(僅納入該抗生素使用發生在住院期間菌株分離之前且連續使用>3 d者)、合并感染、死亡及療效。

2 結果

2.1MLST剔除重復、定植及因保存不當而失活的菌株，最終有60株CRKP感染株納入本研究。共檢測到13種STs，其中ST11為優勢克隆(44/60，73.3%)，其次為ST23(3/60，5.0%)，ST661和ST15各2株(2/60，3.3%)，ST36、ST1688、ST414 、ST290、ST1334、ST147、ST340、ST307和ST528各1株(1 /60，1.7%)。eBurst的結果如圖1所示，ST11、ST340、ST15、ST290、ST36、ST23及ST528具有親緣性，其余均為獨立ST型。同時，本研究還觀察到ST11型CRKP菌株分離自多個部門(主要是ICU)，且在2015年和2016年間均有分離，表明ST11型CRKP流行株在該院存在水平及垂直傳播。

圖1 60株CRKP菌株ST型的eBurst聚類分析

圓圈：ST型；圓圈大小：菌株數的多少；藍色圓圈：共同祖先；黃色圓圈：分支祖先；黑色圓圈：其余所有ST型；圓圈光環中的紫色：該研究和數據庫中均有該ST型

2.2 標本類型及科室分布60株實驗菌株其標本類型包括：痰(71.7%)、血液(13.3%)、分泌物(6.7%)、清潔中段尿(5.0%)及腹水、引流液各1株(1.7%);自12個部門分離出，包括：ICU(41.7%)、呼吸內科(18.3%)、神經內科(10.0%)、急診內科(6.7%)，血液內科及消化內科各3株(5.0%)，急診外科(3.3%)、腫瘤內科、心內科、泌尿外科、燒傷科、胃腸外科、整形外科各1株(1.7%)。進一步將菌株主要的標本類型及科室分布分為ST11組和非ST11組進行比較，結果如表1所示，兩組菌株的標本類型及科室分布的差異無統計學意義，標本類型以痰為主，主要分離自ICU及呼吸內科。

2.3 藥物敏感性試驗60株CRKP菌株的藥敏試驗結果顯示CRKP對絕大數抗生素的耐藥率均>80%，但對氨基糖苷類及四環素類具有一定的敏感性， 見表2。進一步將兩組菌株幾種重要抗生素的耐藥率進行比較，ST11組CRKP菌株對阿米卡星的耐藥率高于非ST11組(P=0.014)，而對其他抗生素的耐藥率的差異無統計學意義。見表3。

表1 ST11組與非ST11組CRKP菌株主要標本類型及科室分布的比較[n(%)]

表2 60株CRKP菌株藥物敏感性試驗結果[n(%)]

a：僅37株菌進行了該抗生素的藥敏試驗

表3 ST11組與非ST11組CRKP菌株對幾種抗生素耐藥率的比較[n(%)]

*：僅37株菌(ST11組27株、非ST11組10株)進行了該抗生素的藥敏試驗

2.4 耐藥基因檢測在60株CRKP感染株中，54株產碳青霉烯酶(其中49株產KPC，5株產NDM)，3株產IMP，1株同時產KPC和NDM，2株同時產KPC和IMP。此外，未檢測到VIM和OXA-48。有59株產ESBLs，其中58株產SHV，46株產TEM，8株產CTX-M。此外，將本研究主要的耐藥基因(KPC、SHV、TEM)分為ST11組和非ST11組進行比較分析。結果如表4所示，兩組感染株SHV(P=1.000)和TEM(P=0.118)的攜帶情況無顯著差異，但ST11組CRKP感染株中產KPC株占95.5%，明顯高于非ST11組(P<0.001)。

表4 ST11組與非ST11組CRKP菌株幾種耐藥基因攜帶情況的比較[n(%)]

2.5 臨床特征單因素分析結果如表5所示，相比于非ST11組，既往使用過頭孢菌素類抗生素(P=0.049)及存在合并菌(P=0.020)可能會增加ST11組CRKP感染的風險。但兩組感染患者在人口統計學、基礎疾病及既往醫療環境的暴露等方面均無明顯差異，且兩組患者院內死亡率及療效也均無明顯差異。多因素分析結果顯示既往使用過頭孢菌素類抗生素(P=0.537)及存在合并菌(P=0.335)差異均無統計學意義。

3 討論

CC258流行株介導CRKP在全世界范圍內的傳播已形成共識,盡管ST258是在歐洲國家觀察到的主要克隆，但ST11是中國CRKP主要的流行克隆[3,6]。該研究對CRKP的感染進行了為期2年的流行病學調查，并進一步針對不同克隆CRKP的感染進行耐藥基因、其他抗生素耐藥率、感染危險因素及結局多角度的比較分析。

該院2015～2016年間共檢出約1 300株肺炎克雷伯菌，在該院腸桿菌科中僅次于大腸埃希菌，其對碳青霉烯類耐藥率從2015年的14.3%上升到2016年的19.1%。鑒于有限的納入標準，最終共有60株CRKP感染菌株納入本研究。MLST結果顯示共檢測到13種STs，ST11是其中最常見的(44/60,73.3%)，這與中國CRKP中ST11型占主導地位的現狀一致，同時也反映出了CRKP感染與定植菌株在流行病學上的一致性。且ST11型CRKP流行株在該院存在水平及垂直傳播。此外，呼吸道是該院CRKP感染的主要途徑，而ICU是該院CRKP感染的高危科室。

表5 ST11組與非ST11組CRKP感染患者臨床特征及結局的比較[n(%)]

藥物敏感性試驗結果顯示CRKP感染菌株對多種抗生素具有廣泛耐藥性，但對氨基糖苷類及四環素類抗生素具有一定敏感性，且已有病例報道過氨基糖苷類結合替加環素的聯合治療可能有效[12]。且進一步研究表明ST11 CRKP感染對阿米卡星的耐藥率更高，其原因可能需要進一步的研究，但這對臨床在ST11型CRKP感染中評估氨基糖苷類抗生素作為治療方案是否合適具有一定參考價值。本研究中CRKP感染株主要的碳青霉烯酶基因型是KPC，其次是NDM及IMP(但未在該院流行)，未檢測到VIM及OXA-48。且進一步分析顯示ST11組產KPC者所占比例明顯高于非ST11組，產KPC肺炎克雷伯菌流行株ST11譜系的高度同一性主要來自克隆擴散，可能與轉座子(Tn4401)有關[13]。此外60株CRKP菌株大多同時攜帶ESBLs，主要以SHV為主，而CTX-M最少。但自20世紀初，CTX-M逐漸成為包括中國在內的許多國家肺炎克雷伯菌ESBLs的主要基因型[14]，因此該結果可能暗示了CRKP中ESBLs的發展與進化。

在本研究中，既往使用過頭孢菌素類抗生素及存在合并感染被認為與ST11型CRKP感染可能相關，但多因素結果無統計學意義，表明兩者可能存在交替作用。過去針對CRKP感染危險因素的研究很多，主要包括合并基礎疾病、醫療環境暴露及既往抗生素的使用等方面[7-9]。但隨著CRKP流行病學的發展，具有不同流行病學特征的非CC258流行株逐漸發揮重要作用。美國一項針對ST258及非ST258克隆的CRKP臨床特征的比較顯示兩組背景特征的相似[15]，而本研究也證實了ST11組與非ST11組CRKP感染患者在人口統計學、基礎疾病及既往醫療環境暴露等方面的差異均無統計學意義，這意味著無論ST型如何，CRKP可能影響著相似人群。此外ST11與非ST11兩組患者在死亡率及療效的差異也無統計學意義，反映了CRKP感染往往表現出高死亡率及治療無效的現狀，對非ST11克隆CRKP的感染也應同樣重視。無論如何，這些結果給該院臨床工作者在CRKP的感染中，尤其是ST11高度流行科室，頭孢菌素作為經驗性用藥的選擇提供參考，且對存在合并感染的患者應盡早采取有效的防止院內感染及傳播的措施。

總之，ST11型CRKP流行株在該院存在院內水平及垂直傳播，且與KPC的產生相關。不同克隆CRKP菌株感染患者具有相似臨床背景及結局，對高危科室及患者應盡早采取有效的經驗性治療及控制感染的措施。