低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料對L929細胞周期及凋亡的影響

李 楠，吳文慧，許 瑩，魏子琰

通常用于生物醫學應用的金屬具以下特點：必須無毒的、非免疫原性的、無血栓和非致癌，并且表現出高耐蝕性[1]。近年來，鈦合金由于其良好的抗疲勞性。高耐腐蝕性和良好的生物相容性被廣泛用于各個領域，包括整形外科、牙科植入和組織工程。許多用于替換身體部位或功能的商業產品，例如人工關節置換、骨創傷產品和口腔植入物，已由鈦合金制造[2]。目前，新型鈦合金的設計與研發也成為熱點話題。為了提升鈦合金的生物學和力學性能，現設計一種低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料，用無毒元素鈦、鈮、鋯、鉬制備合金基底(Ti-27Nb-6Zr-5Mo)，陽極氧化法在合金基底表面原位構建納米氧化層，以作為生物涂層制備的過渡層；采用等離子噴涂法在鈦合金表面制備Ta涂層，形成以新型鈦合金為基底，納米管氧化層為過渡層，表面覆蓋鉭活性涂層的新型醫用鈦合金梯度復合材料。該實驗采用流式細胞儀法，探究低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料對細胞周期及凋亡的影響，為其應用于臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料L929小鼠成纖維細胞(華北理工大學口腔醫學院實驗室提供)。低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料(華北理工大學材料與工程學院)、Ti-6Al-4V(寶雞鈦業有限公司，寶雞)、RPMI1640(CORNING，美國)、PBS(BI，以色列)、FBS(Cegrogen，德國)、25%胰蛋白酶(BI，以色列)、臺盼藍(Leagene，北京)、Propidium Iodide(Sigma，美國)、Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD，美國)，MoFlo XDP流式細胞儀(Beckman，美國)。

1.2 實驗分組按低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料梯度處理的過程，分為Ti-27Nb-6Zr-5Mo組(A組)，經氧化處理的Ti-27Nb-6Zr-5Mo組(B組)，經氧化處理并在其表面等離子噴涂鉭涂層的Ti-27Nb-6Zr-5Mo組(C組)(8個圓形試件/組，直徑10 mm、厚度2 mm)；Ti-6Al-4V組(D組)(6個方形試件/組，長10 mm、厚1 mm)；同時設立陰性對照組(E組)(含10% FBS的培養液18 ml)。

1.3 浸提液制備將試件用無水乙醇浸泡30 min，超聲波清洗器清洗15 min，去離子水沖洗數遍，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。將處理好的試件置于24孔板中，試件表面積與浸提液體積比1.25 cm2/ml[3],將所有試件以含10% FBS的RPMI1640培養基為介質，在37 ℃、5% CO2培養箱中浸提72 h，經 0.22 μm 濾膜過濾除菌備用。

1.4 流式細胞儀法

1.4.1細胞培養及同步化 取對數生長期的L929細胞，用含0.5% FBS培養基同步化24 h后，分別以A、B、C、D組浸提液置換舊培養基，E組加入10% FBS的培養基，繼續培養48 h；25%胰蛋白酶消化細胞，含10% FBS培養基終止消化吹打細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液加3 ml PBS重懸細胞，計數板計數，使每組細胞密度至1×106個/ml。

圖1 各組對L929細胞周期的影響

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組；E：E組

1.4.2臺盼藍鑒定細胞活性 取100 μl細胞懸液在1.5 ml EP管中，加入100 μl臺盼藍(濃度0.4%)輕輕混勻，靜置染色3 min，用細胞計數板分別計數活細胞和死細胞數，計算活細胞率。活細胞率(%)=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

1.4.3流式細胞儀法檢測細胞周期 取不少于1×106個細胞，逐滴加入-20 ℃無水乙醇使其終濃度為70%，并不停振搖，以免細胞成團，-4 ℃條件固定過夜；將固定好的細胞懸液，1 000 r/min離心5 min去固定液，加4 ℃預冷的PBS重懸離心，洗滌2次，300 μl預冷PBS重懸；將離心管內各組細胞懸液移入待測試管并進行標記，加50 μl PI(50 μg/ml)染液混勻，避光染色30 min，取300目篩網過濾細胞懸液，1 h內應用流式細胞儀檢測。

1.4.4流式細胞儀法檢測細胞凋亡 取不少于1×106個細胞，4 ℃預冷的PBS離心洗滌細胞，300目篩網過濾；1 000 r/min離心5 min，500 μl Binding buffer重懸，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl PI混勻，于室溫避光孵育15 min，1 h內應用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 各組對細胞周期影響流式細胞儀檢測各組浸提液培養L929細胞48 h后細胞周期結果。見圖1。在G1期、S期與G2期，4個實驗組與陰性對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞48h不同細胞周期的細胞比例

與D組比較：#P<0.05

2.2 各組對細胞凋亡影響流式細胞儀檢測各組浸提液培養L929細胞48 h后細胞凋亡結果。見圖2。A組與D組相比差異有統計學意義(P<0.05)；B、C、D組與E組相比差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

細胞周期有2個重要階段，即G1期至S期，G2

圖2 各組對L929細胞凋亡的影響

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組；E：E組

表2 各組細胞48 h凋亡率

與E組比較：*P<0.05；與D組比較：#P<0.05

期至M期。在G1期，細胞開始合成RNA和蛋白質為DNA合成做準備；S期即DNA合成期，DNA含量介于二倍體與四倍體之間；G2期是DNA合成后期，此時DNA合成已經完成為四倍體狀態，為下一步有絲分裂做準備；M期為細胞分裂期。由于細胞周期不同時呈現不同特征，故使用流式細胞術分析處理后細胞的DNA含量。由于決定細胞增殖是在即將開始DNA合成并在細胞周期的其余部分進行之前的G1階段進行的，因此在此階段檢測DNA合成可以確定細胞培養物中生長調節的狀態[4]。為不影響實驗的重復性，課題組采用血清饑餓法，將細胞周期阻滯在G0/G1期。本研究表明，A、B、C組與D組S期與G2期的細胞比例均有所增加，鉭涂層組處理48 h后結果更明顯，由此可知，低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料可以促進DNA合成增加。

細胞凋亡是生物材料細胞毒性檢測的一項重要指標[5]。細胞凋亡也被稱為細胞程序性死亡，是指在一定的生理或病理條件下，細胞主動地、高度有序地、自己結束其生命的過程[6]。檢測細胞凋亡的方法有多種，如電子顯微鏡下觀察形態、DNA電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性還可以定量。其中Annexin V/PI雙染法最為常用。細胞凋亡染色結果表明，實驗組與對照組細胞均以活細胞與早期凋亡細胞為主，晚期凋亡與壞死細胞較少；早期凋亡率A組與E組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而B、C兩組與E組比較差異有統計學意義，與D組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明B、C組與D組對細胞凋亡有一定程度影響，但由于Ti-6Al-4V已廣泛應用于臨床，符合要求，并結合細胞周期實驗，課題組的數據表明低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料生物相容性良好。

在復雜的人體生理環境中，除了生物相容性好這一基本要求外，還特別要求醫用金屬材料具有生物功能性、長期穩定性、與骨組織之間有較好的生物力學適配性[7]。因此，在確定低彈性模量醫用鈦合金梯度復合材料是否可以應用臨床前，還需進行長期的生物安全性試驗與骨整合試驗等。