擴增的NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用及其機制

石光環，周世平，徐東升，王 琇

(1.吉林大學第一醫院內鏡診治中心，吉林 長春 130021；2. 吉林大學第一醫院腫瘤科，吉林 長春 130021)

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是人體天然免疫系統的重要組成細胞，其能夠殺傷腫瘤細胞[1-2]。NK細胞治療對血液腫瘤有很好療效[3]，對肺癌[4]和肝癌[5]也有一定臨床療效。研究[6]表明：胃癌患者外周血中NK細胞數明顯低于正常人，且NK細胞數與胃癌患者的臨床病理分期有密切關聯，NK細胞數越少，胃癌患者的臨床病理分期越晚。胃癌患者NK細胞活化程度也明顯低于正常人[7]。有研究[8]顯示：如果能將胃癌患者外周血中NK細胞大量擴增激活，再回輸患者，就有可能增加胃癌患者NK細胞數和改善其功能缺陷，提高胃癌患者的臨床治療效果。本研究旨在探討擴增后NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用及其機制，以期為NK細胞治療胃癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SGC7901細胞購自北京北納創聯生物技術研究院，SGC7901細胞用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI-1640培養基培養傳代，每2～3 d換液1次。FBS和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司，赫賽汀購自瑞士羅氏公司，重組人白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)和重組人白細胞介素5(interleukin-5，IL-5)購自德國美天旎生物技術有限公司，X-VIVO培養基購自瑞士Lonza公司，淋巴細胞分離液購自挪威Nycomed Pharma AS公司，鼠抗人CD3-APC、CD56-PE、KIR2DL1-PE、KIR3DL1-APC、NKG2D-APC和DNAM-1-PE單克隆抗體購自美國BD Biosciences公司，人NK細胞富集試劑盒購自美國Stemcell Technologies公司，鈣黃綠素購自日本同仁化學研究所。倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，CO2培養箱購自美國Thermo公司，離心機購自德國Beckman公司，流式細胞儀購自美國BD公司，酶標儀購自美國BioTeck公司。

1.2 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分離收集15例胃癌患者的臨床資料，其中男性8例，女性15例，年齡36～75歲，中位年齡58歲。根據TNM分期分為Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。15例胃癌患者外周血經3 000 r·min-1離心10 min，將血漿和血細胞分開，血漿置于56 ℃恒溫培養箱中30 min以滅活補體，血細胞采用淋巴細胞分離液分離PBMCs，并采用生理鹽水洗滌2次。

1.3 NK細胞體外擴增采用含有5%自體血漿、50 μg·L-1赫賽汀、500 U·mL-1重組人IL-2和10 μg·L-1重組人IL-15的X-VIVO完全培養基將PBMCs密度調整至3×106mL-1，接種于25 cm2培養瓶中，標記為培養第0天，并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，每2～3 d半量更換1次X-VIVO培養基(含有5%自體血漿，500 U·mL-1重組人IL-2和10 μg·L-1重組人IL-15)。培養至第14天，收集細胞，開始后續實驗。

1.4 NK細胞的形態表現觀察和NK細胞百分比在培養的第0、2、4、6、8、10、12和14天觀察NK細胞的形態，記錄培養液體積，取0.5 mL NK細胞培養基，進行細胞計數，將細胞密度調整為1×106mL-1，取100 μL細胞加入至流式管中，加入CD3-APC和CD56-PE單克隆抗體，室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌2次，100 μL PBS懸起細胞，采用流式細胞術檢測NK細胞百分比。按照0.5 mL培養基中細胞數計算培養基中細胞總數，并根據流式細胞術檢測的NK細胞百分比計算NK細胞實際數。

1.5 NK細胞分離采用人NK細胞富集試劑盒分離PBMCs中的NK細胞和擴增培養后的NK細胞。

1.6 細胞分組和殺傷作用檢測將細胞按照靶細胞和效應細胞比例不同分為實驗組、最小釋放組和最大釋放組。靶細胞處理：收集培養的SGC7901細胞，以PBS洗滌1次，并采用PBS將其密度調整至1×106mL-1，取1 mL細胞，加入鈣黃綠素，使其終濃度為1 μmol·L-1，置于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育30 min。PBS洗滌2次后，采用含5% FBS的RPMI-1640培養基重懸細胞，并將細胞密度調整至5×104mL-1。效應細胞處理：將純化的NK細胞采用含有5% FBS的RPMI-1640培養基重懸細胞，并將其密度調整至5×105mL-1(5∶1)。實驗組：加入100 μL靶細胞和效應細胞，加入圓底無菌帶蓋96孔板中；最小釋放組：加入100 μL靶細胞和100 μL PBS；最大釋放組：100 μL靶細胞和100 μL含有10%TritonX-100的PBS；每組3個復孔。在37℃、5%CO2培養箱中避光孵育4 h。從每孔中輕輕吸取100 μL上清置于新的平底96孔平板中。采用酶標儀檢測上清的熒光值(激發光波長為485 nm，發射光波長為528 nm)，計算擴增前后NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。殺傷活性=(實驗組熒光值-最小釋放組熒光值)/(最大釋放組熒光值-最小釋放組熒光值)×100%。

1.7 擴增前后NK細胞表面活化性受體表達和表面抑制性受體表達收集細胞，以PBS洗滌1次，并采用PBS將其密度調整至1×106mL-1，取100 μL細胞加入流試管中，加入CD3-PerCP和CD56-FITC單克隆抗體，同時分別加入KIR2DL1-PE、KIR3DL1-APC、NKG2D-APC和DNAM-1-PE單克隆抗體及其同型對照抗體，避光孵育15 min后，PBS洗滌1次，100 μL PBS重懸細胞，采用流式細胞術進行檢測。采用FlowJo Version 10軟件分析流式細胞術檢測結果進行表型分析。

2 結 果

2.1 擴增前后NK細胞形態表現培養第0天PBMCs中NK細胞呈圓形，細胞體積比較小，細胞散在分布，偶見細胞集落；培養第3天，PBMCs中NK細胞出現明顯聚集，呈克隆樣生長；培養第7天，PBMCs中NK細胞體積增大，有些細胞形態不規則；培養第14天，不規則形態NK細胞數明顯增多。見圖1(插頁六)。

2.2 擴增前后NK細胞百分比15例胃癌患者中1例代表性胃癌患者擴增前外周血中NK細胞百分比僅為14.1%(圖2A)，經過14 d擴增后，NK細胞百分比達到89.6%(圖2B)。全部15例胃癌患者擴增前外周血中NK細胞百分比為(16.25±6.84)%；經過14 d擴增后，NK細胞百分比為(80.57±9.36)%(圖2C)。擴增后NK細胞百分比明顯高于擴增前(P<0.01)。

A:Percentage of NK cells before expansion(from one patient)；B: Percentage of NK cells after expansion(from one patient); C: Proportion graph of NK cells before and after expansion (from fifteen patients).

圖2 胃癌患者體外擴增前后NK細胞百分比

Fig.2 Percentages of NK cells of patient with gastric cancer before and after amplificationinvitro

在體外擴增NK細胞的過程中，擴增前4 d，NK細胞增殖較慢；擴增第6天，NK細胞數明顯增加；擴增第10天開始，NK細胞增殖速度呈線性增長，該階段是NK細胞大量擴增期,在體外擴增第14天，NK細胞數是擴增前的(596±152)倍。見圖3(每條線代表1例患者NK細胞體外擴增時NK細胞數的變化趨勢)。

圖3 擴增過程中NK細胞增殖曲線

2.3 擴增前后NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性分離胃癌患者PBMCs中擴增前后NK細胞，檢測擴增前后NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性。在效靶比為5∶1時，擴增后NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性(27.99%±6.39%)明顯強于擴增前(12.32%±4.85%)(P<0.01)。見圖4。

2.4 擴增前后NK細胞表面活化性受體和抑制性受體表達百分比擴增后NK細胞表面活化性受體NKG2D(82.44%±15.57%)和DNAM-1(86.86%±11.91%)表達百分比明顯高于擴增前(72.18%±13.98%和67.95%±15.01%，P<0.01)。擴增后NK細胞表面抑制性受體KIR2DL1(18.65%±8.42%) 和KIR3DL1(16.84%±7.92%)表達百分比明顯低于擴增前(29.08%±12.41%和20.97%±9.48%，P<0.01)，表明擴增后NK細胞是活化程度更高的NK細胞。見圖5和圖6。

圖4 擴增前后NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性

Fig.4 Killing activities of NK cells against gastric carcinoma cells before and after expansion

A，C: Flow cytometry diagram; B， D: Scatter plot;A,B:Expression of NKG2D;C,D: Expression of DNAM-1.

A，C: Flow cytometry diagram; B， D: Scatter plot;A,B:Expression of KIR2DL1;C,D: Expression of KIR3DL1.

3 討 論

近年來，腫瘤的NK細胞療法取得了較大進展[9-11]。NK細胞擴增方法主要有2種，一種是滋養層法，一種是細胞因子法[12]。滋養層法即采用致死劑量輻照的腫瘤細胞作為滋養層細胞刺激NK細胞增殖[13-15]。滋養層法雖然能夠在短時間內獲得大量、高純度NK細胞，但是因為這種方法中加入了腫瘤細胞，存在腫瘤細胞繼續增殖的風險，因此限制了該方法的臨床應用。細胞因子法即采用細胞因子刺激NK細胞增殖[16-19]，該方法去除了滋養層細胞成瘤的風險，且在一定的時間內也能獲得大量、高純度NK細胞，可以滿足臨床治療需要。本研究將單克隆抗體和細胞因子聯合來擴增NK細胞，經過14 d培養，NK細胞數能夠滿足臨床治療的需要，且擴增的NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用明顯強于胃癌患者外周血中的NK細胞，表明擴增的NK細胞可以用于胃癌的臨床治療。

NK細胞對腫瘤細胞殺傷可以通過3條途徑：①分泌細胞毒性物質，包括穿孔素和顆粒酶；②分泌細胞因子，包括干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等；③通過抗體依賴細胞介紹的細胞毒作用[20-23]。NK細胞抗腫瘤作用的發揮受到其表面活化分子和抑制分子的調控作用[24]。當活化信號強于抑制信號時，NK細胞被活化，進而發揮抗腫瘤作用[25-26]。本研究結果顯示：擴增后NK細胞表面活化性受體NKG2D和DNAM-1表達明顯高于擴增前，而抑制性受體KIR2DL1和KIR3DL1表達明顯低于擴增前；本文作者發現：擴增后NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用明顯強于擴增前，這可能與擴增后NK細胞表面活化性受體增多而抑制性受體減少有關。當擴增的NK細胞與腫瘤細胞接觸時，高表達的活性受體能夠與其配體相互作用，并向NK細胞傳遞更多的活化信號，進而激活NK細胞，使NK細胞的抗腫瘤活性增強。

綜上所述，經體外擴增后，NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性明顯增強，這可能與擴增的NK細胞表面活化性配體的表達升高、抑制性配體表達降低有關。本研究明確了擴增的NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用及可能機制，為NK細胞治療胃癌提供了理論基礎。