草魚(♀)×赤眼鱒(♂) F1及其親本CAST基因cDNA全長克隆與結構差異

李東放 李耀國, 金生振 何美鳳 肖調義,

(1. 湖南農業大學湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心, 長沙 410128;2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心, 常德 415000)

魚類雜交一般指不同品種、品系、種、屬、亞科等親緣關系較遠的個體之間的交配[1], 其后代可獲得雜種優勢, 在魚類育種工作中具有很大的利用價值[2—5]。遠緣雜交因親本遺傳差異明顯大于近緣雜交, 其雜交子代性狀具有更大的可塑性, 雜種優勢往往表現更為明顯[6]。雜交子代在染色體和DNA水平上可以產生廣泛的變異, 是雜種優勢產生的基礎[7]。赤眼鱒俗稱“野草魚”, 與草魚同屬雅羅魚亞科, 具有較強的抗病能力[8]。已有研究表明, 正交F1(草魚♀×赤眼鱒♂)能正常存活, 且表現出優于草魚的疾病抗性及肌肉品質[9]。

魚類的肉質品質是評價其營養價值的重要指標[10,11]。李迪等[12]比較分析了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1的肉質基本特性, 發現正交F1肌肉比父、母本彈性大、嫩度高, 肉質更堅韌。李偉等[13]測定了草魚、赤眼鱒及正交F1背部肌肉的營養成分, 發現正交F1表現出肌肉彈性大、嫩度高和蛋白質豐富等雜種優勢。但正交F1肉質特征的分子特性及遺傳基礎尚不明確。

蛋白酶系統參與肌原纖維降解過程, 通過鈣離子調控肌原纖維蛋白的性質和比例而影響肉的硬度[14]。作為蛋白酶系統中的重要功能分子和影響肉質嫩度的重要候選基因, 鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)可以特異性識別并抑制鈣蛋白酶(Calpain, CAPN)的表達及自溶穩定性[15]; 最終降低CAPN降解蛋白的速度, 有助于肌肉生長[16]。目前已在鯉(Cyprinus carpio)[17]中克隆和鑒定了CAST基因。該研究克隆了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及其正交F1CAST基因的cDNA全長, 分析并比較三種魚該基因和蛋白結構上的差異, 以期為正交F1肉質的分子及遺傳特征研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

該研究所用的健康草魚、赤眼鱒及正交F1(草魚♀×赤眼鱒♂)均購于瀏陽市北盛鎮烏龍漁場, 所有試驗魚均為2018年5月繁育的個體, 平均體重(14.50±1.25) g, 購回后放于恒溫水循環養殖系統28℃暫養1個月, 每箱放養草魚、赤眼鱒及正交F1各10尾, 每日按其體重的3%早、晚各投喂一次飼料。

1.2 RNA提取及cDNA合成

從養殖系統中選取健康草魚、赤眼鱒及正交F1各1尾, 分別取肌肉組織80 mg, 按總RNA提取試劑盒(Omega, 美國)說明提取總RNA, 用核酸蛋白儀檢測總RNA的質量和濃度, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取2 μg質量和完整性好的RNA(A260/A280值在1.8—2.2), 按第一鏈 cDNA合成試劑盒(Fermentas, 美國) 的說明合成cDNA模板, 用于全長cDNA序列中間片段的克隆。參照SMARTer RACE 5′/3′ cDNA試劑盒 (Clontech, 美國) 說明書分別合成5′-RACE和3′-RACE cDNA模板, 用于5′/3′cDNA末端克隆。

1.3 CAST基因全長cDNA克隆

基于本課題組前期草魚轉錄組測序所得CAST基因部分序列(共1779 bp)以及GenBank中草魚CAST基因片段(登錄號: JF825477.1), 用Oligo7.0軟件設計草魚CAST基因3′ 和5′ 端的特異性擴增引物(表1), 分別以合成的草魚5′和3′-RACE cDNA為模板擴增對應的末端序列。PCR反應條件為94℃預變性5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 60s, 共30個循環; 72℃延伸7min。將得到的目的片段PCR產物切膠回收, 克隆至pMD19-T載體, 挑取陽性克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序。赤眼鱒及正交F1CASTcDNA全長序列獲取參考已得到的草魚CASTcDNA序列, 使用Oligo7.0軟件設計引物; 分別以赤眼鱒第一鏈cDNA及正交F1第一鏈cDNA作為模板擴增中間序列; 赤眼鱒CAST與正交F1CAST5′/3′ cDNA末端序列的獲取同草魚。

1.4 CAST生物信息學分析

使用DNAStar軟件拼接獲得cDNA序列, 利用SMART (https://smart.embl-heidelberg.de)、SignalP 4.1 Server和ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam在線軟件分析氨基酸理化性質、信號肽和蛋白質結構域等, 通過NetPhos 3.1 Server在線軟件預測蛋白磷酸化位點。使用BLAST在線比對分析序列的相似性, 通過DNAMAN對CAST蛋白進行多序列比對; 應用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構建CAST的系統發育樹(分支可信度設為1000次自展檢測); 使用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu) 和PYMOL軟件對蛋白質三級結構進行分析。

表1 本文所用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study

2 結果

2.1 CAST cDNA全長序列分析

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及其正交F1的CASTcDNA全長序列已提交至GenBank, 獲得序列登錄號分別為KT780366.1、KU994884和KU994883。草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CASTcDNA序列全長分別為3036、3165和3086 bp; 其5′端非編碼區依次為104、118和136 bp, 開放閱讀框分別為 2706、2682和2715 bp, 3′端非編碼區依次為226、365和235 bp; 分別編碼901、893和904個氨基酸。利用Blast軟件比對結果顯示正交F1與母本草魚(♀)CASTcDNA全長序列的同源性為94.52%, 高于其與父本赤眼鱒(♂)的同源性(90%)。

2.2 CAST蛋白功能結構域分析

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST的推導蛋白質分子質量分別為93.72、92.77和94.02 kD, 理論等電點依次為5.92、6.01和6.02。NetPhos3.1 Server預測草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST蛋白氨基酸殘基中潛在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸 (Thr) 和酪氨酸 (Tyr) 磷酸化修飾位點。結果表明, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST氨基酸殘基中分別潛在73個 (Ser: 49, Thr: 23, Tyr:1)、82個 (Ser: 54, Thr:26, Tyr: 2)和75個 (Ser: 51, Thr: 23, Tyr: 1) 磷酸化修飾位點。SMART軟件分析結果顯示, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂) 及正交F1均包含4個鈣蛋白酶抑制結構域, 正交F1與草魚對應結構域的結構域排布更為相似(圖1)。

使用I-TASSER和PYMOL軟件預測了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1的CAST蛋白三級結構。預測的蛋白均由主要β-折疊和無規則卷曲結構組成, 草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1CAST分別擁有24、12和20個β-折疊, 在蛋白三級結構上正交F1與草魚更為相近(圖2)。

2.3 CAST鈣蛋白酶抑制結構域差異比對

以草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1為核心對象,選擇金線鲃 (Sinocyclocheilus grahami)、鯉 (Cyprinus carpio)、斑馬魚 (Danio rerio)、爪蟾 (Xenopus laevis)、牛 (Bos taurus)及眼鏡王蛇 (Ophiophagus hannah)作為參照, 通過DNAMAN軟件對此9個物種CAST的4個鈣蛋白酶抑制結構域進行多序。

魚類CAST蛋白的4個鈣蛋白酶抑制結構域中都包含一個保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列(X代表任意氨基酸)。魚類的七肽序列具有高度保守性, 哺乳類、兩棲類和爬行類與魚類七肽序列存在部分差異。草魚(♀)、赤眼鱒(♂)和正交F1的4個鈣蛋白酶抑制結構域序列中均包含高度保守的七肽序列, 其中正交F1與草魚對應的4個七肽序列完全一致, 而與赤眼鱒第1和第4個鈣蛋白酶抑制結構域序列中的七肽序列一致; 赤眼鱒第2和第3個鈣蛋白酶抑制結構域序列中的七肽序列與草魚和正交F1對應序列均存在1個氨基酸殘基差異位點。

2.4 系統進化關系分析

對草魚(♀)、赤眼鱒(♂)、正交F1與不同分類地位物種的CAST進化關系進行分析(圖3), 整個系統發育樹可分為兩個大支: 硬骨魚類聚為一支, 鳥類、爬行類、兩棲類和哺乳類聚為另一支。在硬骨魚類中, 淡水魚 (如鯉、斑馬魚等)和海水硬骨魚類(如巴丁魚Pangasianodon hypophthalmus、虹鱒Oncorhynchus mykiss等)進化距離相對較遠; 正交F1和母本草魚(♀)進化關系較其與父本赤眼鱒(♂)更近。

圖1 CAST蛋白結構域分析Fig. 1 Structural feature analysis of CAST proteins

3 討論

為了更深入地了解草魚(♀)×赤眼鱒(♂)遠緣雜交后代的肉質形成相關分子基礎, 研究克隆獲得了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1三種魚的CASTcDNA全長序列, 并以此為基礎進行了三種魚CAST序列相似性、蛋白組成及修飾、功能結構域特征以及系統進化關系的比較。就CAST而言, 各種不同層面的結構分析結果均提示正交F1與母本草魚(♀)遺傳信息更為接近。據此推測正交F1與母本草魚(♀) CAST蛋白結合Ca2+調節鈣蛋白酶活性的功能可能更相近[18]。

蛋白質磷酸化是由蛋白質激酶催化的磷酸基團轉移反應, 是常見且重要的蛋白質翻譯后修飾方式之一[19], 亦是生物調節控制蛋白質活力和功能的有效途徑[20]。真核生物中主要在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基位點發生磷酸化修飾[21]。該研究通過預測草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1磷酸化修飾位點, 獲知草魚CAST蛋白共有73個磷酸化位點, 赤眼鱒共有82個磷酸化位點, 而正交F1具有75個潛在磷酸化位點。正交F1與草魚(♀)的磷酸化位點相比僅相差2個絲氨酸磷酸化位點, 而與赤眼鱒存在1—3個數量不等的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點差異。磷酸化修飾位點數量多少可以直接影響到蛋白質活性[22,23], 因而三種魚CAST蛋白的調節活性及功能可能存在差異。據此推測正交F1CAST蛋白活性與母本草魚更相似, 是偏向于受母本遺傳信息影響的雜交種。

草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST蛋白均具有4個典型的鈣蛋白酶抑制結構域, 與鯉[17]等其他魚類中CAST蛋白研究結果相一致。CAST 4個鈣蛋白酶抑制結構域的任一結構域均能抑制一種CAPN蛋白活性, 完整的 CAST 蛋白能夠同時抑制4個CAPN 蛋白分子[24]。對不同物種鈣蛋白酶抑制結構域的氨基酸殘基序列分析發現, 魚類CAST蛋白的4個鈣蛋白酶抑制結構域均各包含一個保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列。該序列可能是CAST蛋白起抑制作用的關鍵部位, 魚類同哺乳類等該區域的差異可能導致CAST蛋白抑制CAPN的作用效果不同[25—27]。該研究發現正交F1與母本草魚(♀)七肽位點序列完全一致, 而與父本赤眼鱒(♂)存在部分位點的差異, 預示正交F1CAST抑制CAPN的功能與草魚更接近, 而同赤眼鱒可能存在差異[28]。此外, 相對于哺乳動物而言, 魚類CAST蛋白缺少了L結構域; 雖然此結構域的功能尚未明確, 但可能是魚類和哺乳類之間CAST序列同源性及功能差異形成的主要影響區域[29]。本研究團隊通過質構儀對正交F1及其親本的肉質進行了測定, 研究結果顯示正交F1綜合了雙親的優異肉質特性, 呈現出彈性大, 嫩度高, 肉質堅韌等品質;亦分析過CAST在草魚、赤眼鱒及其正交F1肌肉中的表達量, 結果顯示正交F1CAST基因表達量與赤眼鱒無顯著差異, 而顯著高于其母本草魚[12]。CAST基因表達量差異對肉質的影響有待深入研究。

圖2 CAST三級結構預測Fig. 2 3D structure prediction of CAST

圖3 CAST系統發育樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of CAST

4 結論

該研究首次獲得了草魚(♀)、赤眼鱒(♂)及正交F1CAST的cDNA全長序列, 發現正交F1CAST在序列同源性、蛋白組成和修飾、功能結構域特征以及系統進化關系等方面與母本草魚(♀)更為接近;表明正交F1CAST功能可能與母本草魚(♀)更相似。所得數據為進一步解析鈣蛋白酶系統在魚肉品質形成過程中的作用提供了分子基礎。