溶藻細菌篩選及溶藻活性物質對銅綠微囊藻生理活性的影響

陳莉婷 左 俊 宋立榮 劉 津 甘南琴

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

淡水水體富營養化問題日益加劇, 大范圍、高生物量、高危害特征的藍藻水華頻繁暴發。這不僅會破壞水體生態系統的結構和功能, 制約湖泊水資源的可利用性, 危害人類及動植物的健康生存, 也會影響社會經濟的可持續發展。研究和發展控藻抑藻關鍵技術, 對于湖泊水環境的健康發展和水資源的可持續利用具有重要的理論和現實意義。與常規的物理法、化學法控藻技術相比,利用微生物控藻具有經濟、特異、安全的優勢,是一種頗具應用前景的修復、凈化富營養化水體的方法, 引起了越來越多研究者的關注[1]?？v觀國內外的研究, 微生物控藻法中報道最多的是利用溶藻細菌控制藍藻水華。這些溶藻細菌多為革蘭氏陰性菌, 一般分離自發生水華或赤潮的海洋、湖泊及水庫, 少數分離自土壤, 適合在水華發生初期投入使用, 短期內即可抑制藻類生長, 緩解甚至消除水華[2]。

溶藻細菌的脅迫能夠影響藻細胞內的一系列生理過程, 比如阻礙電子傳遞降低藻細胞光合系統活性、抑制葉綠素a等色素合成或一系列與光合作用相關基因的表達、產生氧化損傷引起藻細胞膜脂過氧化和抗氧化酶失活、阻礙胞內蛋白質和碳水化合物合成、擾亂胞內正常的離子代謝、破壞細胞結構引起細胞基質外溢等[3—6]。

溶藻細菌篩選的常用方法為將已純化菌株的固體斜面純培養物或液體培養基中的純培養物接種到藻液中[7,8], 通過觀察藻液的黃化確定其是否為溶藻菌。菌株的純化和培養通常使用的培養基為Luria-Bertani(LB)培養基, 但大多數研究未關注LB培養基自身的抑藻作用及其在溶藻細菌篩選過程中的影響[9—11]。

本研究指出了使用細菌的LB液體純培養物篩選溶藻菌時存在風險和弊端, 并對篩選所得溶藻細菌的溶藻方式及溶藻活性物質對銅綠微囊藻生理活性的影響進行了初步探究。一方面為溶藻細菌篩選方法的選擇提供參考, 另一方面為修復、凈化富營養化水體的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養

本實驗所用藻種為銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7806, 由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB)提供。藻株所用培養基為BG-11[12], pH為7.1—7.2。培養溫度為(25±1)℃, 光照為25 μmol/(m2·s), 實驗光源為冷光源(Philip), 光暗周期比為12h∶12h。藻細胞培養至對數生長期后用于實驗。

1.2 菌種分離與純化

從太湖竺山灣(31.45° N, 120.03° E)、梅梁灣(31.41° N, 120.19° E)采集藍藻水華水樣, 經0.8 μm的濾膜(Millipore)過濾, 濾液用無菌水稀釋至不同梯度后涂平板, 再反復平板劃線分離純化菌株。細菌培養基為LB: NaCl 10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、蒸餾水1000 mL, pH約為7.5。培養溫度為30℃, 轉速為140 r/min。配制固體培養基時需加入1.5%(m/v)的瓊脂粉。

1.3 溶藻細菌的篩選及鑒定

LB液體純培養物感染藻細胞挑取單克隆接種于LB液體培養基, 培養48h后, 以10%的體積比將細菌培養物添加到藻液中, 另設一個加入等體積LB液體培養基的LB組, 空白對照組(CK組)藻液中加入等體積的無菌水。每2天取樣測定藻液的葉綠素a(Chlorophylla, Chl.a)濃度。

LB固體斜面純培養物感染藻細胞挑取單克隆接種于LB固體斜面, 待細菌菌落長出, 用無菌水沖涮, 吹打均勻制成菌苔洗脫液, 最后用無菌水調配細胞密度至5×108cells/mL左右。以10%的體積比添加菌苔洗脫液到藻液中, 空白對照組(CK組)藻液中加入等體積的無菌水。每2天取樣測定藻液的葉綠素a濃度。

鑒定將溶藻菌的PCR產物送往公司測序,所測得的16S rDNA序列經校對后, 在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的GenBank數據庫中用局部相似性基本查詢工具(BLAST)進行核苷酸序列同源性比較。利用MEGA6.0軟件, 采用鄰接法(Neighbor-joining, 重復度F1000)構建系統發育樹,對篩選出的溶藻細菌進行種屬鑒定[11]。

1.4 LB培養基主要成分抑藻試驗

配制與LB液體培養基中等濃度的酵母提取物溶液、蛋白胨溶液、NaCl溶液, 以10%的體積比分別添加至藻液中, 空白對照組(CK組)加入等體積的無菌水, 于12孔板中培養。每天搖勻3次, 一周后觀察各孔中藻液的生長狀況。

將酵母提取物溶液以10%的體積比添加至藻液中, 空白對照組(CK組)加入等體積的無菌水, 于三角瓶中培養, 測定實驗過程中藻液的生物量變化。生物量以藻液在680 nm處的吸光值(OD680)來表示。

1.5 溶藻方式探究

分別將菌株THW7的無菌濾液、菌體重懸液、原始菌液以10%的體積比加入藻液中, 一周后取樣測定葉綠素a的濃度, 分析各處理液的溶藻效果。

1.6 溶藻活性物質對銅綠微囊藻生理活性影響的試驗

將菌株THW7的無菌濾液以5%的體積比加入藻液中, 對照組加入等體積無菌水, 于500 mL三角瓶中培養。每組設置3個平行, 每2天取樣測定相關生理指標, 生理指標包括: OD680、葉綠素a濃度、Fv/Fm(最大光化學量子產量)、α(光能轉化效率)、ETRm(最大電子傳遞速率)、MDA(丙二醛)含量及抗氧化酶活性。(1)紫外可見分光光度法[13]測定藻液的葉綠素a濃度和OD680值; (2)葉綠素熒光參數Fv/Fm、α、ETRm用Water-PAM測定; (3)MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[14]; (4)SOD(超氧化物歧化酶)活性采用核黃素-NBT(氯化硝基四氮唑藍)光化還原氧化法測定[15], POD(過氧化物酶)活性采用愈創木酚法測定[4], CAT(過氧化氫酶)活性采用鉬酸銨法測定[16], 粗酶液中可溶性蛋白含量利用南京建成生物工程研究所的蛋白測定試劑盒進行測定。

1.7 溶藻效果的評價

以葉綠素a的去除率表征溶藻效果, 公式如下:葉綠素a的去除率(%)=[(C0-C)/C0]×100)式中，C0為每組實驗初始時的葉綠素a濃度(mg/L),C為每組實驗測定時的葉綠素a濃度(mg/L)。

1.8 數據整理與統計分析

采用Excel 2013對實驗數據進行整理, 利用SPSS 19.0進行數據分析。所有數據均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。圖象繪制使用OriginPro 9.1。

2 結果

2.1 溶藻細菌的篩選及鑒定

本研究共分離、純化出93株細菌, 經篩選鑒定共得到7株溶藻細菌, 這里僅以菌株THW4和THW7為例, 展示細菌篩選的不同結果。需指明的是研究中以LB固體斜面純培養物感染藻細胞的結果作為確定溶藻菌的標準, 即LB固體斜面純培養物添加至藻液后能引起葉綠素a濃度顯著降低的菌株為溶藻細菌。

LB液體純培養物和LB固體斜面純培養物溶藻效果試驗期間, 對照組微囊藻葉綠素a濃度持續升高; 各處理組的葉綠素a濃度降低(圖1A), 均顯著低于對照組(P＜0.01)。菌株THW7的LB液體純培養物加入藻液后, 藻液葉綠素a濃度持續下降, 第2、第4、第6天葉綠素a濃度顯著低于其他各組(P＜0.01)。第6天時葉綠素a濃度為0.326 mg/L, 僅為初始水平的28.07%, 溶藻效率為71.93%。LB組和菌株THW4的LB培養物組葉綠素a濃度在第2天時均有不同程度的升高, 2d后開始呈下降趨勢, 其中LB組的下降速率顯著高于菌株THW4培養物組的下降速率(P＜0.01)。第6天時LB組的葉綠素a濃度為0.685 mg/L, 溶藻效率為41.04%; THW4培養物組的葉綠素a濃度0.891 mg/L, 溶藻效率為23.34%。

菌株THW4的斜面洗脫液加入藻液后, 葉綠素a濃度逐漸升高, 趨勢與對照組相同; 菌株THW7的斜面洗脫液加入藻液后, 藻液明顯黃化, 葉綠素a濃度逐漸下降(圖1B), 顯著低于對照組和菌株THW4斜面洗脫液組(P＜0.01)。第6天時, 菌株THW7斜面洗脫液組的葉綠素a濃度降至0.162 mg/L, 僅為初始水平的15.23%, 溶藻效率為84.77%。

圖1 兩株細菌不同培養物的溶藻效果Fig. 1 Algae-lysing effects of different culture solution of two bacteria in LB liquid culture

溶藻細菌的鑒定形態觀察和生理生化試驗結果顯示溶藻細菌THW7為G-菌, 短桿狀, 接觸酶陽性, 淀粉水解陰性, 能利用氨基酸和酯類, 菌落顏色為乳白色, 光滑、不透明、較濕潤。利用16S rDNA序列進行比對分析, 構建系統發育樹, 鑒定其為假單胞菌屬(Pseudomonas), 與蒂氏假單胞菌Pseudomonas teessideatype strain PR65T(AM419154.2)的親緣關系最近(圖2), 16S rDNA基因的相似性為99.79%。目前未見關于蒂氏假單胞菌溶藻的報道。

2.2 LB培養基不同成分抑藻效果

添加蛋白胨溶液和NaCl溶液的兩組藻液呈藍綠色, 藻細胞生長狀況良好; 添加LB液體培養基和酵母提取物的藻液呈白色, 說明藻細胞生長受到抑制甚至死亡(圖3)。

酵母提取物溶液添加至三角瓶中藻液的試驗結果顯示對照組藻生長良好, OD680直線升高; 酵母提取物溶液組的藻從第2天開始迅速下降, 8d時OD680降至0.080(圖4), 顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.3 溶藻方式分析

試驗初始的銅綠微囊藻葉綠素a濃度為1.162 mg/L。一周后, 對照組藻液生長狀況良好; 原始菌液組、無菌濾液組的銅綠微囊藻生長受到明顯抑制,藻液發黃甚至泛白, 葉綠素a濃度分別降至0.571和0.443 mg/L, 均顯著低于對照組(P＜0.01), 溶藻效率分別為50.84%和61.84%; 菌體重懸液對銅綠微囊藻的生長幾乎沒有起到抑制作用, 葉綠素a水平與對照組基本一致, 無顯著性差異(圖5)。

2.4 銅綠微囊藻的生理指標

生長情況試驗初始的銅綠微囊藻OD680為0.254, 葉綠素a濃度為0.817 mg/L。對照組藻液生長狀況良好, OD680和葉綠素a濃度逐漸升高; 處理組OD680和葉綠素a濃度的變化趨勢相似, 逐漸下降(圖6), 顯著低于對照組(P＜0.01)。第10天時, OD680降至0.041, 葉綠素a含量降至0.046 mg/L, 僅為初始水平的5.62%, 溶藻效率達94.38%。

光合系統活性試驗期間對照組的銅綠微囊藻生長狀況良好, 藻細胞的一系列葉綠素熒光參數Fv/Fm、α、ETRm一直保持較高水平; 而投加溶藻菌THW7無菌濾液的處理組,Fv/Fm、α、ETRm呈迅速下降的趨勢(圖7), 均顯著低于對照組(P＜0.01)。處理組的Fv/Fm在第6天降至0.032, 僅為初始值的9.94%, 第8天降為零。ETRm和α在試驗初始約1h的樣品處理時間內即開始降低, 第2天分別降低到試驗初始值的21.81%、42.81%, 從第4天開始, 均降至檢測限以下。

圖2 溶藻細菌THW7系統發育樹Fig. 2 The phylogenetic tree of the algalytic bacterium THW7

MDA含量及抗氧化酶活性對照組MDA含量始終維持在一個較低的水平; 處理組的MDA含量在第2天降至初始值的75.75%, 2d后迅速升高(圖8)。第4天時處理組的MDA含量升高至初始值的1.62倍, 顯著高于對照組的MDA含量(P＜0.05); 第6和第8天, 其MDA含量分別升高至初始值的1.99倍、2.77倍, 均顯著高于對照組(P＜0.01)。

對照組酶活在一定范圍內上下波動, 變化不大;處理組的SOD、POD、CAT活性呈現先升高后降低的趨勢且一直高于對照組, 其中CAT活性變化最顯著, 2d時即升至初始水平的9.47倍(圖9)。處理第4天、第6天, SOD活性分別升高至初始水平的1.25倍、1.73倍, POD活性分別升高至初始水平的1.90倍、6.19倍, CAT活性分別升高至初始水平的為初始水平的7.76倍和11.85倍, 均顯著高于對照組的相應酶活性(P＜0.01)。處理第8天, SOD、POD活性雖大幅下降, 但仍高于對照組, 其中POD活性為初始水平的3.08倍。CAT活性在第8天未降低, 繼續升高至初始水平的14.15倍, 顯著高于對照組的CAT活性(P＜0.01)。

圖4 酵母提取物對藻生長的影響Fig. 4 Effects of yeast extract on algae growth

圖5 溶藻細菌THW7不同處理液的溶藻效果Fig. 5 The algicidal effect of different THW7 treatment solutions

圖6 THW7的無菌濾液對銅綠微囊藻生長的影響Fig. 6 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the growth of Microcystis aeruginosa, as determined by the OD680

3 討論

3.1 溶藻菌的篩選及溶藻方式的探究

LB培養基為常用的細菌培養基, 多用于溶藻細菌篩選過程中的菌株擴培。多數研究采用細菌的LB液體培養物感染藻液來篩選溶藻菌, 但很少注意到LB培養基本身所具有的溶藻作用[9,10]。本研究結果表明, LB培養基具有一定的溶藻作用, 其主要成分酵母提取物具有較高的溶藻效率。鄭小平等[17]也發現添加培養基至藻液中導致葉綠素a濃度顯著下降, 第7天由初始值1.650 mg/L降至0.865 mg/L, 但并未對其進行深入探究和解釋。另有研究雖然將LB培養基添加至藻液中作為對照, 但未曾發現其抑藻、溶藻作用[11], 這可能與其試驗中LB培養基添加的比例較低有關。為避免培養基在篩選溶藻菌的過程中造成干擾, 部分研究在篩選溶藻菌時將液體培養物離心后反復洗滌[18], 但這一方法往往只能篩選得到直接溶藻的溶藻菌, 多數間接溶藻的細菌易被篩掉。因此采用LB液體純培養物感染藻液篩選溶藻菌存在較大的假陽性或漏篩風險。

篩選溶藻菌的另一種方式為將固體斜面培養基上形成的菌苔收集后感染藻液, 通過藻細胞的生長情況來確定菌株是否具有溶藻作用[9]。本研究中將兩株細菌THW4和THW7的LB固體斜面純培養物接種到藻液中, 結果發現僅有菌株THW7具有溶藻作用, 前者藻細胞正常生長, 與對照組無差異, 說明該方式可有效避免LB培養基帶來的干擾。因此在篩選溶藻菌時, 應使用菌株的LB固體斜面純培養物感染藻液或在利用LB液體純培養物篩選的過程中設置嚴格的空白對照, 或選用對藻生長無影響的細菌培養基如改良基礎檸檬酸培養基、R2A培養基等。

菌體重懸液中僅有菌體, 無菌濾液中僅有細菌的分泌物, 未經任何處理的原始菌液既包含細菌的分泌物又包含菌體。本研究結果顯示同時含有細菌分泌物的無菌濾液組和原始菌液組均表現溶藻效果, 這表明THW7產生溶藻作用的因子為胞外分泌物, 菌體本身無溶藻效果, 即菌株THW7通過分泌溶藻活性物質至胞外的方式間接溶藻。這是報道最多的一種溶藻方式, 氣單胞菌屬、假交替單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬等多通過的這種方式溶藻[19—23]。已有研究指出假單胞菌能分泌抗生素或生物堿類活性物質溶藻[24,25],關于該菌的活性物質組成有待進一步研究。

圖7 THW7的無菌濾液對銅綠微囊藻光合活性的影響Fig. 7 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the photosynthetic activity of Microcystis aeruginosa

3.2 溶藻活性物質對銅綠微囊藻生理活性的影響

葉綠素a作為藻類細胞重要的組成成分, 也是可用來表征浮游植物生物量的最常用的指標之一[13]。在本研究中, 添加溶藻細菌THW7無菌濾液后, OD680和葉綠素a濃度均顯著降低, 說明銅綠微囊藻的生長受到顯著抑制。

光合作用的強弱可直接反映自養型生物的生長情況, 而葉綠素熒光技術是一種方便、快速且靈敏的測量植物在逆境條件下光合作用的有效方法,它以植物體內葉綠素作為探針[26]。通過測定活體的一系列葉綠素熒光參數如Fv/Fm、Yield、α、ETRm等, 就可知光能吸收、電子傳遞、光能轉化等過程的強弱, 這也能在一定程度上反映藻細胞的光合系統活性, 表征微藻的生長環境良好與否。在正常生理狀態下, 這些參數值比較穩定、變化很小,但在脅迫條件下明顯下降[5]。在本研究中, 處理組的Fv/Fm、α、ETRm參數值均顯著下降直至檢測限以下, 這種變化比藻細胞生長、MDA含量、抗氧化酶酶活的變化更迅速。這說明在THW7無菌濾液的脅迫下, 銅綠微囊藻細胞的光合系統II迅速受到影響, 光合系統活性降低, 表現為電子傳遞受阻、光能轉化效率降低, 光合作用逐漸喪失。

圖8 THW7的無菌濾液對銅綠微囊藻細胞內MDA含量的影響Fig. 8 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the MDA content in Microcystis aeruginosa

由不飽和磷脂構成的細胞膜容易受到氧自由基攻擊和破壞, 導致MDA積累, 故其含量可作為表征生物細胞膜脂過氧化程度的重要指標, 反映細胞膜完整性被破壞的程度[3]。本研究中處理組的MDA含量從第4天開始一直增加, 顯著高于對照組。這表明在溶藻菌THW7無菌濾液的脅迫下, 藻細胞受到氧化損傷, 且細胞膜脂過氧化的程度隨著時間不斷加重。

藻類在正常代謝過程和各種環境脅迫下均能產生活性氧和自由基, 它的積累將引起細胞結構的破壞和功能的紊亂, 生物機體出于自我保護, 除了還原性谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素等非酶系統做出應激防御, 體內的抗氧化防御系統也起著重要作用, 通過生成各種抗氧化酶、升高酶活等使細胞內的活性氧維持在較低水平以確保正常生長和代謝[27],當脅迫解除后, 酶活可得到不同程度的恢復。

藻細胞在受到脅迫時細胞內MDA含量和抗氧化酶活性會呈現先升高后降低的趨勢, Su等[4]研究發現在一株銅綠假單胞菌脅迫下, 藻細胞內MDA含量逐漸積累, CAT、POD活性迅速升高后又急劇降低。Hou等[5]報道一株芽孢桿菌B1的液體培養物能夠降低藻細胞的葉綠素a含量, 抑制一系列與光合作用相關基因如psbA、psbD、rbcL等的表達, 且MDA含量升高, 抗氧化系統和細胞內部結構受損,最終藻細胞溶解死亡, 引起內容物外泄。Kong[6]的研究也發現溶藻細菌脅迫引起抗氧化酶活性升高,且發酵液濃度越高, SOD、POD、CAT酶活升高程度越大。Shi等[28]甚至發現在棕鞭藻培養濾液的脅迫下, 微囊藻的生長也會受到抑制, MDA含量和CAT活性明顯增加。與以上研究相似, 本研究中一系列抗氧化酶活性在溶藻物質的脅迫下總體呈現先升高后降低的趨勢, 這說明在一段時間內溶藻菌THW7所產生的溶藻活性物質會對微囊藻細胞結構和抗氧化系統造成一定的損傷。

圖9 THW7的無菌濾液對銅綠微囊藻細胞內抗氧化酶酶活的影響Fig. 9 Effect of THW7 bacteria-free filtrate on the antioxidant enzyme activity in Microcystis aeruginosa

4 結論

LB培養基中的酵母浸提物具有一定的溶藻作用, 僅采用LB液體培養物進行溶藻菌篩選存在假陽性或高估溶藻效率的風險, 而采用其固體斜面培養物篩選溶藻菌則可避免。篩選得到的溶藻細菌THW7通過分泌胞外活性物質的方式間接溶藻, 該溶藻物質會抑制銅綠微囊藻細胞的生長和光合作用, 破壞細胞膜結構完整性并使細胞內抗氧化系統受到損傷。