海洋酸化對泥蚶精子運動的影響及作用機理初探

施 巍 韓 毓 閆茂倉 黃賢克 胡利華 柴雪良 劉廣緒

(1. 浙江大學動物科學學院, 杭州 310058; 2. 浙江省海洋水產養殖研究所, 溫州 325005)

自工業革命以來, 人類大量使用化石燃料以及森林的砍伐等活動導致大氣中二氧化碳(CO2)濃度不斷上升。據統計, 大氣中的CO2濃度已從工業革命前的280 ppm(標準大氣壓比)增長了約40%, 目前已達到了近400 ppm[1,2]。由于海洋與大氣間存在著持續不斷的氣體交換, 大氣中的CO2會不斷溶入海洋, 進而造成海水變酸, 即“海洋酸化”現象[3]。根據聯合國政府間氣候變化專門委員會(Intergovernmental Panel on Climate Change, IPCC)預測, 如果不能大幅度減少CO2的排放速度, 全球表層海水的pH會在本世紀末降至7.8, 而這一數值將在2300年繼續降到7.4[3]。由于棲息于更易受空氣CO2濃度變化影響的近岸環境, 海洋貝類尤其是潮間帶雙殼貝類被認為是最先和最容易受到海洋酸化影響的物種之一, 因此這些物種對海洋酸化的響應引起了國內外學者的廣泛關注[4—6]。目前的相關研究表明,未來海洋酸化情景能對海洋貝類的受精、胚胎發育、生物鈣化和生理代謝等諸多生命過程產生不利影響, 進而對海洋貝類及其所處的生態系統構成嚴重威脅[7—9]。

大多數海洋雙殼貝類通過廣播式體外受精進行繁殖, 其直接將配子排放到開放的水體中, 受精率主要依賴于配子在水體中的相互作用[10]。根據海洋無脊椎動物受精動力學模型, 貝類精子的游動速度越快也就意味著單位時間內其與水體中卵子相遇的概率越大, 受精的幾率更高[11,12]。雖然之前的研究表明, 海洋酸化顯著抑制海洋貝類精子的運動能力, 但迄今為止該影響的細胞與分子作用機理仍知之甚少[7,13]。

眾所周知, 精子運動主要依靠ATP供能, 而精子細胞內絕大部分ATP是由線粒體通過三羧酸循環經無氧糖酵解途徑產生的[14]。糖酵解效率由每一步反應對應的催化酶調控, 而這些酶的活性和催化能力大多都與細胞內的pH密切相關。此外, 精子尾部存在大量Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase), 該酶調節了精子內Ca2+水平和精子生理功能[15,16]。之前的研究表明, Ca2+-ATPase的缺失或活力降低都將導致精子運動能力的衰減[15,16]。盡管海洋酸化已被證實會影響到海洋生物細胞內的pH和離子平衡[8], 但海洋酸化是否通過影響海洋貝類精子ATP合成及Ca2+-ATPase酶活, 進而導致精子活力降低, 還有待進一步研究證明。

泥蚶(Tegillarca granosaLinnaeus), 俗稱“血蚶”, 屬軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 列齒目(Taxodonta), 蚶科(Arcidae), 廣泛分布于印度洋與西太平洋近岸海域, 是我國重要的經濟養殖貝類物種之一[17—19]。針對海洋酸化影響精子運動的細胞與分子機理尚不明晰的現狀, 本研究以泥蚶為研究對象, 根據IPCC所預測的2100年和2300年海洋酸化情景, 分析了未來海洋酸化條件(pH7.8和7.4)對泥蚶精子運動的影響, 并通過對比不同海洋酸化條件下泥蚶精子ATP合成中關鍵酶及Ca2+-ATPase酶活力等指標, 探討了其影響精子運動的作用機理。

1 材料與方法

1.1 泥蚶的采集與暫養

實驗所用的性成熟泥蚶[殼長(35.6±4.33) mm]于2014年6月取自浙江省溫州市樂清灣(東經121°,北緯28°), 隨后被轉移至浙江省海洋水產養殖研究所(清江試驗站)。經海水小心沖洗除去殼表污物后, 將泥蚶于室內2000 L大桶中流水暫養一周[海水pH為8.07±0.07, 鹽度為(21.2±0.1)‰, 溫度為(26±3)℃]。在暫養過程中, 桶內海水保持連續充氣, 每日早中晚定時投喂活體扁藻(Platymonas subcordiformis，密度為2×104個/mL)三次, 以保證泥蚶處于適宜的性成熟狀態。

1.2 海洋酸化模擬與參數測定

實驗設置三個pH海水處理組, 其中對照組使用正常海水(pH8.1), 另根據IPCC的預測設置兩個海洋酸化模擬實驗組(pH分別為7.8和7.4)。對照組充入除濕后的空氣, 而酸化海水則通過加富CO2的方式制備[9,20]。在實驗過程中, 海水的pH通過Sartorius PB-10型pH計監測, 溫度和鹽度使用WTW Multi 3410型多參數水質分析儀測得。同時實驗期間每半小時使用電位滴定法測定一次實驗海水的總堿度[21]。利用實驗測得的海水pH、鹽度、總堿度和溫度, 結合部分已知常量, 使用開源軟件CO2SYS計算得出實驗過程中海水的碳酸鹽體系組分和文石(Ωara)與方解石飽和度(Ωcal)參數[22]。各組海水的理化參數如表1所示。

1.3 泥蚶精子的收集與酸化處理

根據之前報道的催產方法, 泥蚶精子通過陰干和溫度刺激法獲得[9,23]。在實驗前一晚, 將大小均一的泥蚶從暫養桶內撈出, 沖刷干凈后置于23℃的空調房陰干過夜。次日將每個泥蚶個體單獨置于裝有500 mL過濾海水的燒杯中進行催產, 期間燒杯中保持持續充氣。待泥蚶開始排放配子后停止充氣, 待大約45min后收集精子懸浮液, 在顯微鏡(Nikon,Eclipse E600)下檢查精子質量, 并用血球計數板測量精子濃度。每份精子樣品均至少測定三次以減少取樣誤差[24]。為確保結果的準確性, 實驗中舍棄活力低下和濃度過低的精子樣品。

為避免泥蚶個體差異帶來誤差, 實驗中將來自同一個泥蚶個體的精子樣品均分為三份, 然后分別施以對照或酸化處理。酸化處理1h后, 取各組精子樣品用于后續對比分析。

1.4 精子運動速度分析

相應實驗處理1h后, 取100 μL精子懸液置于單凹載玻片上, 并蓋上載玻片以減少器壁效應(Walleffect)對實驗結果的影響[25]。隨后樣品置于裝有錄像系統(DXM1200F, Nikon)的顯微鏡(Eclipse E600,Nikon)下以200×放大倍數進行觀察并對精子運動情況進行錄像(至少30s)。使用開源軟件ImageJ(版本1.46r)中的計算機輔助精子分析(Computer Aided Sperm Analysis, CASA)插件, 對錄像數據進行分析。通過測定精子在不同時間點的位置坐標, 構建運動軌跡, 進而計算得到各組精子運動的曲線運動速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)和直線速度(VSL)[10,12]。本研究共檢測了來自15個泥蚶個體的精子樣品在不同處理后的運動情況(共計45份精子樣品)。

表1 對照組與酸化實驗組的海水理化參數值(均值±標準誤)Tab. 1 Chemical parameters of seawater in the control and experiment groups (Mean±SE)

1.5 泥蚶精子ATP含量測定

經酸化處理1h后, 每個處理組取90 mL精子樣品置于離心管中, 于離心機(5810R, Eppendorf)中以3000 r/min離心2min, 棄上清獲得精子用于ATP含量測定。首先采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P0006, 碧云天), 按照試劑盒提供的方法對泥蚶精子蛋白濃度進行定量。隨后使用ATP含量測定試劑盒(A095-1, 南京建成), 利用分光光度計(UV-2100, 上海菁華)測量樣品在636 nm波長處0.5 cm光徑的吸光度值, 并按照以下公式計算得到各樣品的ATP濃度值(μmol/g prot)。

1.6 精子丙酮酸激酶(PK)和磷酸果糖激酶(PFK)酶活測定

本研究使用丙酮酸激酶測定試劑盒(A076-1,南京建成)對不同處理組泥蚶精子的丙酮酸激酶(PK)活力進行測定。根據試劑盒的操作要求加樣并混勻后, 在340 nm波長0.5 cm光徑處測定樣品在30s時初始吸光值(A1)。隨后加入反應液, 37℃水浴15min, 測定反應后樣品的吸光值(A2)。按照以下公式計算PK酶活力。

將37℃下每克組織蛋白每分鐘將1 μmol的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉變成丙酮酸定義為一個酶活力單位(UPK)。

與之類似, 利用磷酸果糖激酶測試盒(A129, 南京建成)對樣品的磷酸果糖激酶(PFK)活力進行測定。按照試劑盒說明書操作要求加入試劑于1 mL比色皿后, 記錄樣品在340 nm波長下20s時的初始吸光值(A1)和10min 20s時的吸光值(A2)。隨后按照以下公式計算PFK酶活力。

1.7 泥蚶精子Ca2+-ATPase酶活測定

本研究使用超微量Ca2+-ATPase酶測定試劑盒(A070-4, 南京建成)對不同處理后的泥蚶精子Ca2+-ATPase活性進行測定。按照試劑盒所述的操作步驟, 加樣完畢后, 利用分光光度計測定對照與樣品在636 nm波長處0.5 cm光徑的吸光值, 并通過以下公式計算得到Ca2+-ATPase酶活值。

將每小時每毫克細胞蛋白的細胞中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量定義為一個ATP酶活力單位, 即μmol磷/ g (prot ·h,) UATPase。

1.8 數據統計與分析

利用Levene檢驗和Shapiro-Wilk檢驗來分別判斷數據是否符合方差齊性和正態性分布, 對不符合的數據進行平方根反正弦變換以滿足相關統計分析要求。通過單因素方差分析(One-way ANOVA)檢測泥蚶精子的運動速度、ATP含量及PK、PFK和Ca2+-ATPase酶活力在各實驗組間的差異。并通過Tukey檢驗(Post-hoc Tukey tests)進行多重比對,明確組間的顯著性差異。所有統計分析均在R統計分析軟件(Rdevelopment Core Team, 2012)中進行,以P＜0.05作為顯著性檢驗標準。

2 結果

2.1 海洋酸化對泥蚶精子運動速度的影響

與對照相比, 海洋酸化處理導致泥蚶精子運動速度顯著降低(P＜0.05), 且該影響隨著酸化程度的提高而顯著增強。經過pH7.8的酸化海水處理后,泥蚶精子的VCL、VAP和VSL分別降至對照組的82.5%、62.8%和76.2%。隨著海水pH的進一步下降(pH7.4), 泥蚶精子VCL、VAP和VSL分別進一步降至僅為對照組的66.9%、53.3%和54.7%(表2)。

2.2 海洋酸化對泥蚶精子ATP含量的影響

單因素方差分析結果顯示, 海洋酸化導致泥蚶精子ATP含量顯著下降(P＜0.05)。如圖1所示, 經海洋酸化處理1h后, 泥蚶精子ATP含量在pH7.8和7.4處理組中分別下降至對照組的62.9%和35.6%,說明泥蚶精子供能在海洋酸化的條件下被顯著抑制。

2.3 海洋酸化對磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)酶活的影響

統計結果表明, 海洋酸化顯著抑制了泥蚶精子PFK和PK的酶活力(P＜0.05)。ANOVA與Tukey檢驗顯示pH7.8和7.4酸化實驗組的泥蚶精子PFK活力顯著低于對照組, 分別只有對照組的76.9%和45.8%(圖2)。與之類似, 在經pH7.8和7.4的海水酸化處理1h后, 泥蚶精子的PK酶活力也分別相較于對照組顯著下降了33.1%和50.0%(圖3)。

表2 海洋酸化對泥蚶精子運動速度的影響(均值±標準誤)Tab. 2 Effects of ocean acidification on the sperm motility of T.granosa (Mean±SE)

圖1 海洋酸化對泥蚶精子ATP含量的影響(均值±標準誤)Fig. 1 Effects of ocean acidification on the ATP content in T.granosa sperm (Mean±SE)

圖2 海洋酸化對泥蚶精子磷酸果糖激酶(PFK)酶活力的影響(均值±標準誤)Fig. 2 Effects of ocean acidification on the on the activities of 6-phosphofructokinase (PFK) in T. granosa sperm (Mean±SE)

圖3 海洋酸化對泥蚶精子丙酮酸激酶(PK)酶活力的影響(均值±標準誤)Fig. 3 Effects of ocean acidification on the activities of pyruvate kinase (PK) in T. granosa sperm (Mean±SE)

2.4 海洋酸化對泥蚶精子Ca2+-ATP酶活的影響

單因素方差分析顯示, 海洋酸化處理顯著抑制了泥蚶精子Ca2+-ATPase活力(P＜0.05)。雖然與對照相比, 泥蚶精子Ca2+-ATPase活力在經pH7.8的酸化海水處理后并未發生顯著性變化(P＞0.05), 但pH7.4的海水酸化處理后導致泥蚶精子Ca2+-ATPase活力顯著下降了60.2%(P＜0.05, 圖4)。

圖4 海洋酸化對泥蚶精子Ca2+-ATPase酶活影響(均值±標準誤)Fig. 4 Effects of ocean acidification on the activities of Ca2+-ATPase in T. granosa sperm (Mean±SE)

3 討論

無論是在哺乳動物或者海洋無脊椎動物中, 精子運動速度都是衡量雄性生育能力的一個重要指標[11,26]。本研究發現, 未來海洋酸化情景能顯著削弱泥蚶精子的運動速度(包括VCL、VSL和VAP)。根據受精動力學模型, 泥蚶精子運動速度的降低意味著其與散布在三維水體內的卵子相遇幾率的下降,這無疑會導致其受精率的降低[10,12]。盡管類似的結果在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、紫海膽(Heliocidaris erythrogramma)和指形鹿角珊瑚(Acropora digitifera)等物種中已有報道[27,28,39], 但海洋酸化影響海洋無脊椎動物精子運動能力的作用機理一直沒有定論。根據本研究所得到的結果, 海洋酸化影響泥蚶精子運動能力的原因可以從以下幾個方面進行初步解釋。

首先, 海洋酸化可能通過阻礙泥蚶精子的激活來損害其運動能力。體外受精的魚類、貝類的精子在精巢或精漿內一般處于靜止狀態, 只有當釋放到適宜的水體環境中才被激活[30,31]。因此, 水體環境鹽度、溫度和pH等理化條件的變化有可能造成精子激活失敗和運動能力減弱[32,33]。已有研究證實, 泥蚶精子的激活同樣受到外界海水pH的調節和影響。例如, 當環境水體的pH由8下降到7.5時, 泥蚶精子的激活率、總運動時間和激烈運動時間都會明顯降低[34]。鑒于此, 海洋酸化很可能會干擾泥蚶精子的正常激活, 從而導致其運動能力的下降。

其次, 海洋酸化能影響精子供能系統, 阻礙精子尾部的擺動, 最終削弱精子的游動能力。眾所周知, 精子的運動時主要是由其細胞內的線粒體產生ATP以供給能量, 因此精子線粒體ATP的合成效率對保障其活力至關重要。之前有研究報道, 海膽(Centrostephanus rodgersii)精子的線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP)在海洋酸化的條件下會顯著降低, 這將導致精子的ATP合成酶在酸化條件下無法利用質子梯度的勢能偶聯合成ATP[35]。本研究也發現, 經酸化處理后的泥蚶精子ATP含量較對照組有顯著下降。同時, 由于PFK和PK是糖酵解的關鍵酶, 對糖酵解合成ATP速率的控制和調節起著關鍵的作用[36,37], 因此本研究中發現的酸化導致PFK和PK活力顯著降低, 將無疑會抑制精子ATP的合成并進而影響精子的運動。

此外, 海洋酸化還可能干擾了精子的胞內Ca2+調控, 從而影響了其運動能力。大量研究證實,Ca2+通過介導精子質膜表面的Ca2+通道對精子運動進行調控, 隨后通過改變動力蛋白臂的滑動, 使精子鞭毛不停擺動并調節其運動的對稱性[16,38—40]。根據報道, 胞外pH水平能影響Ca2+的內流及其胞內濃度[8,41]。例如, 當外界的pH由7.5降至6.5時, 小鼠突觸小體中Ca2+的內流會被顯著抑制[41]。同樣的,在海洋酸化的條件下, 泥蚶血淋巴內的Ca2+濃度也會隨著海水pH的下降而明顯降低[8]。因此, 海洋酸化也很有可能導致精子胞內Ca2+紊亂, 從而削弱其運動能力[41]。另一方面, Ca2+-ATPase在海洋無脊椎動物的精子中維持著胞內Ca2+濃度的穩定, 并在精子的運動及受精過程中發揮著重要的作用[42]。例如, 用Ca2+-ATPase抑制劑5(6)-carboxyeosin處理海膽精子會導致精子胞內Ca2+濃度變化并造成鞭毛運動能力喪失[42]。在本研究中, 海洋酸化處理后的泥蚶精子的Ca2+-ATPase活力顯著下降, 這意味著海洋酸化很有可能會因此打破精子胞內Ca2+穩態, 干擾其對本已有限的ATP能量的利用, 從而導致其運動能力的顯著下降。

綜上所述, 本研究表明海洋酸化可能通過阻礙精子供能以及干擾精子運動調控, 進而抑制泥蚶精子的運動能力, 繼而降低泥蚶精卵碰撞的概率, 最終影響泥蚶的受精過程及其種群繁衍。