6種新型冠狀病毒核酸檢測試劑的檢測性能對比觀察

李懿，李東曉，王博昊，馬紅霞，郭萬申，黃學勇

河南省疾病預防控制中心,鄭州450016

新型冠狀病毒(2019-nCoV)是冠狀病毒家族中的一種，蝙蝠被認為是冠狀病毒的天然宿主，由于外界環境的改變或者病毒的變異，冠狀病毒跨越種系屏障傳染給人類及其他動物，如鳥類、嚙齒動物[1～7]。冠狀病毒可以引起呼吸道及神經方面的疾病[8,9]。此次COVID-19具有發熱、干咳、乏力、頭疼等臨床表現及肺部影像學改變[10～14]。自2019年12月武漢市發現多例COVID-19患者以來[15,16]，COVID-19疫情在我國其他省份持續擴散。截止到2020年2月17日，全國確診患者70 639例，疫情形勢十分嚴峻。近日，美國、韓國、日本、新加坡等國家也陸續報出COVID-19患者，COVID-19已經成為世界衛生公共安全所要面對的問題。根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》的要求，對COVID-19疑似患者的確診，需要進行2019-nCoV核酸檢測，或者進行2019-nCoV基因測序[17,18]。基因測序成本高、周期長，多數衛生醫療機構不具備開展基因測序條件，因此實時熒光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸成為COVID-19確診的主要方法。實時熒光RT-PCR試劑研發和生產速度較快[19]，在中國疾控中心公布 2019-nCoV基因序列后，多家試劑公司迅速推出各種2019-nCoV核酸檢測試劑。目前僅有少量文獻對2019-nCoV核酸檢測試劑進行評價[20,21]，且涵蓋的試劑種類較少。2020年1～2月，本研究采用6種2019-nCoV核酸檢測試劑檢測了47例COVID-19疑似患者咽拭子樣本中的2019-nCoV核酸，對不同試劑的2019-nCoV核酸陽性檢出率及CT值進行了對比觀察，評價不同試劑的檢測性能，為臨床及檢測部門選取合適的檢測試劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 檢測試劑及受檢標本來源 依據國家《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》[22]。2019-nCoV核酸檢測試劑：試劑A(上海輝睿生物科技有限公司，無批號，無醫療器械注冊證書編號)、試劑B(上海捷諾生物科技有限公司，批號：GZTR2020005，國械注準20203400058)、試劑C(上海伯杰醫療科技公司，批號：20200202A，國械注準20203400065)、試劑D(上海之江生物科技股份有限公司，批號：P20200106，國械注準20203400057)、試劑E(圣湘生物科技股份有限公司，批號:2020002,國械注準20203400064)、試劑F(中山大學達安基因股份有限公司,批號：2020008,國械注準20203400063)。咽拭子標本來源于河南省轄市疾控中心送檢的47例COVID-19疑似患者標本。6種檢測試劑的基本信息見表1。

表1 6種2019-nCoV核酸檢測試劑的模板量、PCR反應條件、最低檢測限及結果判讀標準

1.2 6種2019-nCoV核酸檢測試劑對受檢標本中2019-nCoV核酸(ORF1ab、N基因)的檢測 在生物安全柜內，打開標本運輸箱，取出待檢咽拭子標本。將咽拭子采樣管充分振蕩混勻后靜置10 min，取上清1 mL轉移至2 mL螺口管中。采用西安天隆科技有限公司生產的病毒DNA/RNA提取試劑盒(CDC)(批號：20011010T014 )和NP968核酸提取系統提取咽拭子的RNA，取出適量標本液加入預裝病毒裂解液的板中，用封口膜或者蓋子蓋緊，靜置10 min讓病毒滅活，具體操作按照試劑盒說明進行。PCR反應體系配制和反應條件均參照各個試劑盒說明。使用Roche公司的LightCycler96實時熒光定量PCR儀進行PCR反應，并參照各個試劑盒檢測說明書設置反應程序。結果以CT值表示。在結果判讀上6種試劑稍有區別，試劑A、B、C結果為可疑時需要重復檢測，若復檢結果與初始結果一致可判定為陽性，否則為陰性；試劑D復檢時僅ORF1ab為陽性，即可判斷為核酸陽性。試劑E、F不需要重復檢測。

對47例COVID-19疑似患者的咽拭子標本進行2019-nCoV ORF1ab、N基因檢測，取均能檢出ORF1ab和N基因的咽拭子標本5份，將5份咽拭子中的核酸進行10倍的倍比稀釋，稀釋至原液的10倍和100倍后，再用6種試劑分別檢測ORF1ab和N基因，取兩個基因CT值的平均值作為COVID-19核酸的最終CT值。

2 結果

2.1 受檢標本中6種2019-nCoV核酸檢測試劑檢測的2019-nCoV ORF1ab基因、N基因CT值及陽性檢出率比較 試劑A：2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為36.61(26.70～38.89)、33.54(27.19～38.23)，陽性檢出率為78.7%(37/47)；試劑B：2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為30.76(24.37～37.00)、33.26(27.34～39.20)，陽性檢出率為78.7%(37/47)；試劑C： 2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為31.86(24.10～37.68)、31.63(25.27～37.10)，陽性檢出率為83.0%(39/47)；試劑D：2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為34.68(30.84～39.63)、33.33(27.85～39.22)，陽性檢出率為78.7%(37/47)；試劑E：2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為31.61(24.61～39.20)、30.21(21.61～38.86)，陽性檢出率為80.9%(38/47)；試劑F：2019-nCoV ORF1ab基因、N基因 CT值分別為33.53(25.92～39.43)、31.92(24.62～38.10)，陽性檢出率為83.0%(37/47)。試劑A、B、C、E、F對2019-nCoV ORF1ab、N基因陽性檢出率及CT值比較，P均>0.05。在對ORF1ab基因的檢測中，試劑C、E、F優于試劑A、B、D，但差異無統計學意義。對N基因的檢測中，試劑A、B、C、E、F陽性檢出率基本一致，試劑D的陽性檢出率為74.5%(35/47)。

2.2 6種2019-nCoV核酸檢測試劑檢測不同濃度2019-nCoV核酸的CT值比較 試劑A、B、C、E、F均能檢出5份咽拭子不同稀釋濃度的2019-nCoV核酸，試劑D檢出率只有60%(6/10)。因為試劑D檢出率太低，故未統計試劑D的檢測結果。試劑A、B、C、E、F檢測2019-nCoV核酸的CT值分別為30.30±2.39、28.68±2.34、27.63±2.14、25.96±2.57、28.43±2.38，試劑A、B、C、E、F檢測10倍稀釋的2019-nCoV核酸CT值分別為33.75±2.13、32.03±2.56、31.01±2.15、29.28±2.62、31.65±2.44，試劑A、B、C、E、F檢測100倍稀釋的2019-nCoV核酸CT值分別為37.20±2.13、35.27±1.99、34.35±2.78、32.49±2.54、35.02±2.35。試劑A、B、C、E、F檢測3種不同濃度2019-nCoV核酸的CT值比較，P均>0.05。

3 討論

COVID-19現在已經成為世界公共衛生安全所要面對的問題，準確、快速地對COVID-19疑似患者進行病原鑒定十分重要。準確的2019-nCoV病原鑒定對COVID-19疑似患者治療方案的確定、感染的控制都起著關鍵作用[23]。本研究選取了市場上可以購買的6種2019-nCoV核酸檢測試劑，3種是《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第二版)》推薦使用的試劑，又選取了3種有醫療器械注冊證號的檢測試劑。目前從國家食品藥品監督管理總局的官網上能查到的6種2019-nCoV的檢測試劑(實時熒光RT-PCR法)，除了華大生物科技的2019-nCoV核酸檢測試劑(實時熒光RT-PCR法)我們沒有對比到，其余5種試劑均在本次對比中。

我們比較了這6種2019-nCoV核酸檢測試劑對COVID-19疑似患者咽拭子標本進行2019-nCoV ORF1ab基因、N基因檢測，結果發現試劑C、F對2019-nCoV ORF1ab基因、N基因陽性檢出率最高，其次是試劑E、A、B，三種試劑的陽性檢出率基本相同。試劑D對咽拭子標本的2019-nCoV核酸檢出陽性率處于中等水平，我們根據其說明書判斷，重復檢查ORF1ab單獨陽性，結果也判讀為陽性，但是其N基因的檢出率最低，僅為74.5%(35/47)。

對比這6種試劑對陽性2019-nCoV核酸原液、10倍稀釋、100倍稀釋這三個濃度的檢測發現，除了試劑D不穩定，不能同時檢測出ORF1ab和N基因，其余5種試劑都能同時檢出ORF1ab和N基因。試劑A、B、C、E、F檢測的不同濃度核酸稀釋液CT值比較差異無統計學意義，證明這5種試劑均具有良好的穩定性;而且檢測各稀釋濃度的CT值差值在3.3左右波動，表明這5種試劑的檢測準確性較高，檢測的重復性也較好。

綜上所述，本研究評價的6種試劑中，除了D試劑對2019-nCoV ORFlab和N基因的檢出率較低外,其余5種試劑均能檢出ORFlab及N基因。試劑A、B、C、E、F對不同濃度陽性2019-nCoV核酸標本的檢出能力差異不明顯，均具有較好的穩定性。這5種試劑均可滿足實驗室及臨床檢測要求，可作為COVID-19疑似患者的確診檢測試劑。但本研究仍有不足之處。6種試劑各自推薦了不同的核酸提取方法，在樣本處理和核酸提取過程中，為盡快完成標本的處理，減少檢測人員暴露的機會，要盡量減少離心、開蓋等操作步驟，降低風險，所以在檢測過程中沒有選擇各個試劑推薦的核酸提取方法，而選取了操作步驟少、提取時間短和市場上使用較多、較成熟的磁珠法來提取咽拭子標本的核酸。這樣有可能會出現核酸提取試劑與檢測試劑不太匹配的情況，提取試劑的殘留也可能會影響試劑的擴增效率。本研究僅對比47份COVID-19疑似患者咽拭子樣本的檢測結果，樣本數量有限，不能有效地評價試劑的敏感性和特異性。另外，我們僅對比了各試劑的其中一個批號，并不能完全代表各個試劑的整體檢測性能。如有條件，需選擇同一試劑的多個批次進行有效評價，以滿足臨床檢測所需。