MEKK3蛋白K391位點(diǎn)突變對(duì)其影響的生物信息學(xué)分析及活性鑒定

薄秀梅, 張榮麗, 徐 洲

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)學(xué)分中心，徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，徐州 221004；3.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221004)

MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extr acellular signal-regulated kinase kinase kinase 3)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的重要成員，可被一系列細(xì)胞外信號(hào)(如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、環(huán)境應(yīng)激等)激活[1]，通過(guò)磷酸化的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等生物學(xué)過(guò)程。其氨基酸序列包含 N-端 Phox1/Bem1p(PB1)結(jié)構(gòu)域，C-端富含絲氨酸/蘇氨酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域(kinase, S-TKc)，內(nèi)含活化環(huán)(activation loop，T-loop)，誘導(dǎo)T-loop內(nèi)二聚物的形成可激活JNK、MAPK等，因此二聚化是激活MEKK3磷酸化的重要過(guò)程[2]。催化結(jié)構(gòu)域中391位的賴(lài)氨酸Lys(K)是一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于MEKK3磷酸化相應(yīng)底物發(fā)揮激酶活性非常重要。磷酸化作用可使MEKK3蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，提高與底物的結(jié)合度，緩解催化區(qū)域位阻[3]，從而參與信號(hào)分子的活化及信號(hào)傳遞過(guò)程。

研究表明，MEKK3參與激活多種神經(jīng)相關(guān)的信號(hào)通路[4-6]，還與帕金森病的發(fā)生及神經(jīng)血管生成等神經(jīng)生理病理活動(dòng)相關(guān)[6-8]。MEKK3與下游同樣具有PB1結(jié)構(gòu)域的MEK5結(jié)合，并將其磷酸化，激活ERK5信號(hào)通路[5]。JNK通路是炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的信號(hào)通路，而炎癥是介導(dǎo)神經(jīng)元壞死的重要因素[9]，MEKK3是如何介導(dǎo)JNK通路并誘發(fā)炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。該研究采用生物信息學(xué)方法分析比較了野生型MEKK3WT及突變型MEKK3K391M蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異，并檢測(cè)了其是否可以激活JNK以鑒定其活性，為研究MEKK3的相互作用分子及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌DH5α、pCMV-Tag-2c、PC12細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室提供；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；抗β-actin、p-JNKs、JNK多抗為Sigma產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素酶標(biāo)記二抗(來(lái)源于鼠)為Sigma產(chǎn)品；Protein G PLUS-agarose(sc-2002)為SantaCruz產(chǎn)品；Tris堿，購(gòu)自Sangon公司；胎牛血清及小牛血清購(gòu)自Gibco BRL；硝酸纖維素(NC)膜，購(gòu)自Boehringer Mannheim；各種電泳Protein Marker以及各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自MBI公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，免疫沉淀試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR

根據(jù)Genbank中所報(bào)道人的MEKK3基因編碼序列(NM_203351)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物，同時(shí)在預(yù)突變的位置設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)堿基引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其引物的堿基序列如下:

FLAG-MEKK3WT-F′(P1):5′GTCAGAATTCCA ATGGACGAACAGGAGGCATTG 3′

FLAG-MEKK3WT-R′(P2): 5′GTCACTCGAGG TGAGAGCTCAGTACATGAGC 3′

FLAG-MEKK3K391M-F′(P3): 5′GAACTTGCTTCCATGCAGGTCCAATTTG 3′

FLAG-MEKK3K391M-R′(P4): 5′CAAATTGGA CCTGCATGGAAGCAAGTTC 3′

下劃線部分分別為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)G/AATTC與XhoⅠ的酶切位點(diǎn)C/TCGAG。以PC12細(xì)胞為材料，提取總RNA，以此為模板用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，以cDNA為模板用引物(Pl、P2)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)約1 896 bp的全長(zhǎng)片段MEKK3。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用引物(P2、P3)和(P1、P4)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增目的片段，獲得長(zhǎng)約1 200 bp的上游片段和約700 bp的下游片段，用此片段與引物(P1、P4)經(jīng)重疊延伸PCR法擴(kuò)增出長(zhǎng)約1 896 bp的MEKK3K391M全長(zhǎng)片段，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增帶后，切下含目的基因的凝膠塊，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，純化后的產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒FLAG-MEKK3WT及FLAG-MEKK3K391M

將獲得的MEKK3及突變體目的基因片段和質(zhì)粒(pCMV-Tag-2c)經(jīng)EcoR I和XholⅠ酶切，酶切片段在DNA連接酶作用下，連入pCMV-Tag-2c載體。產(chǎn)生連接產(chǎn)物：FLAG-MEKK3WT/K391M，取5 μL連接產(chǎn)物加入到制備好的感受態(tài)細(xì)菌DH5α中，將轉(zhuǎn)化后的200 μL細(xì)菌涂在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上，孵育過(guò)夜。待細(xì)菌長(zhǎng)出后，選取白色菌落在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，篩選陽(yáng)性重組子委托上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列分析。

1.2.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒在PC12細(xì)胞中的表達(dá)

取測(cè)序正確的陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，利用DNA中量制備試劑盒抽提需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，電泳分析并將質(zhì)粒最終濃度調(diào)至1 μg/μL，-20 ℃保存用于轉(zhuǎn)染。將PC12細(xì)胞傳代至60 mm一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將DNA和脂質(zhì)體分別加入無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，混勻，靜置5 min后將DNA與脂質(zhì)體混合，放置20 min，將已傳代的PC12細(xì)胞用1 mL無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基清洗一遍，加入DNA與脂質(zhì)體混合物，再加入1 mL無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。4 h后，再加入2 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。20 h后，將培養(yǎng)基換成含10%小牛血清加藥或者不加藥的DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)收集細(xì)胞，離心后保存于-20 ℃。

1.2.4 蛋白樣品制備及Western-blot免疫印跡分析

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用PBS收集，離心5 min，棄上清。加入適量含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，超聲裂解，離心。收集上清一部分用1×SDS電泳樣品緩沖液煮沸變性，-20 ℃保存，另一小部分通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白提取物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓80 V，200 min)轉(zhuǎn)膜，封閉，PBST洗3次(5 min/次)，加一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次(5 min/次)，加二抗25 ℃避光孵育2 h，PBST洗3次(5 min/次)，暗室曝光。

實(shí)驗(yàn)參照本間智晴的方法設(shè)定馴化時(shí)間，主要測(cè)定放聲后魚(yú)群的聚集率（標(biāo)志框內(nèi)魚(yú)尾數(shù)與總魚(yú)尾數(shù)的百分比）。以及放聲后魚(yú)群的反應(yīng)時(shí)間和聚集時(shí)間。實(shí)驗(yàn)馴化時(shí)間分為兩個(gè)階段，第一階段為先放聲60s，停止放聲60s，接著再放聲30s后投餌120s，總時(shí)間為270s；第二階段為先放聲90s，停止放聲60s，再放聲30s后投餌120s，總時(shí)間為300s。實(shí)驗(yàn)天數(shù)為12d，每日馴化4次。投餌量參照佐藤靖的研究報(bào)告，1次投餌量為15.7g。

1.2.5 生物信息學(xué)比較分析

進(jìn)入GenBank下載人源MEKK3的基因和氨基酸序列。用ProtParam分析MEKK3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及穩(wěn)定性;用ProtScale、TMHMM預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親/疏水性和跨膜區(qū);借助PredictProtien和Swiss-Model在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，用Swiss-Pdb Viewer 3.7軟件分析定點(diǎn)突變對(duì)MEKK3三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。PROVEAN[10]預(yù)測(cè)氨基酸替換對(duì)蛋白質(zhì)生物功能的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 MEKK3蛋白的理化性質(zhì)分析和預(yù)測(cè)

借助ProtParam軟件對(duì)MEKK3蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，并與MEKK3K391M進(jìn)行比對(duì)。人MEKK3蛋白由626個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為71 kD，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為9.02，說(shuō)明MEKK3是堿性蛋白質(zhì)。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中預(yù)測(cè)的半衰期為30 h、酵母體內(nèi)大于20 h、大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)大于10 h，不穩(wěn)定系數(shù)是59.97，高于40，根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，推測(cè)MEKK3為不穩(wěn)定蛋白。疏水性平均值為-0.699，表明是親水蛋白質(zhì)。對(duì)MEKK3K391M進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示相對(duì)分子質(zhì)量不變;蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為8.95，與野生型蛋白大致相同;疏水性平均值為-0.690，點(diǎn)突變并未改變蛋白質(zhì)親/疏水性；蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為59.47，雖然也高于40，但比野生型蛋白不穩(wěn)定值稍低。

2.2 預(yù)測(cè)與分析MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白親/疏水性和跨膜區(qū)

使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)MEKK3WT蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果顯示，MEKK3WT蛋白親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是289位的天冬酰胺(asparagine, N),分值為-3.144;疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是576位的異亮氨酸(iosle ucine, I)，分值為1.889。MEKK3WT蛋白親/疏水肽鏈分布在整個(gè)序列中是親水蛋白。突變蛋白MEKK3K391M親/疏水性的最強(qiáng)位點(diǎn)均未改變，如圖1所示。用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件對(duì)MEKK3WT蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果顯示，MEKK3WT蛋白626個(gè)氨基酸殘基全部在膜外，不存在跨膜區(qū)域，突變體MEKK3K391M蛋白跨膜區(qū)與MEKK3WT蛋白一致，如圖2所示。

圖1 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的親/疏水性

圖2 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

2.3 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

PredictProtien(https://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測(cè)MEKK3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有14個(gè)α-螺旋和17個(gè)β-折疊，α-螺旋和β-折疊的氨基酸比率分別為18.69%和14.38%。MEKK3K-391M的α-螺旋和β-折疊分別變?yōu)?3個(gè)和21個(gè)，在 3～418位點(diǎn)MEKK3蛋白形成4個(gè)螺旋區(qū)(3～18、66～76、99～106、403～417)，MEKK3K391-M蛋白形成3個(gè)螺旋區(qū)(3～17、66～76、402～418);在537～561位點(diǎn)MEKK3蛋白形成2個(gè)螺旋區(qū)(537～538、553～561)，MEKK3K391M蛋白形成3個(gè)螺旋區(qū)(555、557～558、560～560)；在607～616位點(diǎn)MEKK3蛋白只有1段螺旋(613～616)而MEKK3K391M分為2段螺旋(607、613～616)；在44～417位點(diǎn)，MEKK3蛋白形成5個(gè)β-折疊(44～49、55～58、81～87、99～106、403～417)，而MEKK3K391M形成9個(gè)(46～51、57～59、83～85、90～91、118～120、360～364、367～367、375～381、387～395)；MEKK3蛋白在590～616處形成4個(gè)β-折疊(590～592、594～602、607、613～616)，而MEKK3K391M沒(méi)有。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，兩者的蛋白結(jié)合位點(diǎn)有變化，MEKK3蛋白有13個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，MEKK3K391M有17個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，比MEKK3蛋白多了66、96、124～126、175、222、261、292～293、300、521位點(diǎn)，而少了22、34、173～174、364位點(diǎn),如圖3所示。

○為兩者不同處

2.4 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用PROSITE(www.expasy.org/prosite)軟件預(yù)測(cè)分析MEKK3蛋白含有PB1結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(protein kinase domain)，PB1結(jié)構(gòu)域含有80個(gè)氨基酸殘基(Asp44～Gln123)，蛋白激酶結(jié)構(gòu)域含有261個(gè)氨基酸殘基(Trp362～Ala622)，蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中含有許多ATP結(jié)合位點(diǎn)，其中Leu368、Gly369、Gln370、Gly371、Ala372、Phe373、Gly374、Arg375、Val376組成核苷酸結(jié)合區(qū)域，Lys391為氨基酸與化學(xué)物質(zhì)相互作用的位點(diǎn)，Asp489位點(diǎn)具有酶活性直接參與催化作用。MEKK3K391M蛋白Leu368～Val376無(wú)核苷酸結(jié)合功能，Met391位點(diǎn)不能與化學(xué)物質(zhì)相互作用，具有酶活性的位點(diǎn)Asp489也無(wú)催化功能，如圖4所示。分析表明，Lys391突變?yōu)镸et391，該位點(diǎn)失去與化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合能力。

圖4 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的結(jié)構(gòu)域

2.5 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

將MEKK3蛋白序列輸入蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)平臺(tái)Swiss Model(https://www.Swissmodel.expasy.org/)后，對(duì)蛋白進(jìn)行同源建模，如圖5(a)所示。進(jìn)一步分析MEKK3蛋白的氨基酸序列與模型蛋白質(zhì)相似性波形圖，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的波形較穩(wěn)定且大部分的氨基酸殘基分值不低于0.6，該模型趨近真實(shí)情況，如圖5(b)所示。使用Swiss-Pdb Viewer 3.7軟件分析預(yù)測(cè)MEKK3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)空間位阻的變化。MEK-K3蛋白K391突變?yōu)镸391后，側(cè)鏈基團(tuán)形成的氫鍵并無(wú)變化，但是靠近反應(yīng)中心的原子側(cè)鏈占有的空間位置變大，增大了空間位阻，如圖6所示。利用PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)預(yù)測(cè)單一氨基酸替換對(duì)MEKK3蛋白質(zhì)功能區(qū)的影響，設(shè)定閾值為-2.5，其準(zhǔn)確度(balanced acurracy)達(dá)到77.9%。此時(shí)發(fā)現(xiàn)突變型K391M的得分(PROVEAN score)為-5.394，小于-2.5，表示該突變?yōu)橛泻ν蛔儭?/p>

圖5 MEKK3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)及其同源蛋白質(zhì)相似性波形圖

□為突變位點(diǎn)在MEKK3三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置；→表示 LYS391側(cè)鏈基團(tuán);→表示MET391側(cè)鏈基團(tuán)

2.6 MEKK3相互作用蛋白分析

分析可知,與MEKK3相互作用的大部分是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，它們之間也存在緊密的相互作用關(guān)系。

圖7 MEKK3蛋白的相互作用

2.7 MEKK3WT和MEKK3K391M重組體構(gòu)建

圖8 MEKK3和MEKK3K391M測(cè)序結(jié)果(部分)

以PC12細(xì)胞提取的總RNA為模板，用RT-PCR的方法獲得MEKK3全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)重疊延伸PCR獲得MEKK3K391M全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒FLAG-MEKK3/K391M，篩選陽(yáng)性重組子測(cè)序分析，2個(gè)重組子測(cè)序結(jié)果表明：FLAG-MEKK3與GenBank登記的序列完全一致；FLAG-MEKK3K391M成功將編碼391位賴(lài)氨酸(Lys)的密碼子AAG突變?yōu)榫幋a甲硫氨酸(Met)的密碼子ATG，與預(yù)期結(jié)果完全一致，測(cè)序結(jié)果(部分)如圖8所示。

2.8 MEKK3WT和MEKK3K391M在PC12細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染FLAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M的PC12細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液處理，SDS-PAGE分離后，以抗MEKK3的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明，F(xiàn)LAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M均得到高效表達(dá)，如圖9所示。

2.9 MEKK3WT和MEKK3K391M蛋白生物活性鑒定

將MEKK3WT和MEKK3K391M重組體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明，JNK蛋白表達(dá)在MEKK3組和MEKK3K391M沒(méi)有明顯變化，而P-JNK在MEKK3組的條帶明顯深于對(duì)照組和MEKK3K391M組。

而P-JNK含量在MEKK3K391M組與對(duì)照組中相差不大。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)MEKK3激酶能激活JNK，使JNK發(fā)生磷酸化反應(yīng)，P-JNK含量升高。而MEKK3K391M失去活性，無(wú)法激活JNK，如圖10所示。

1為control(vector)；2為MEKK3WT；3為MEKK3K391M

1為control(vector)；2為MEKK3；3為MEKK3K391M

3 討論

利用生物信息學(xué)手段分析預(yù)測(cè)了MEKK3蛋白的理化性質(zhì)及跨膜區(qū)，結(jié)果表明MEKK3是堿性、親水性蛋白質(zhì)，MEKK3定點(diǎn)突變后其蛋白質(zhì)親水性以及跨膜區(qū)未改變，而穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。對(duì)MEKK3蛋白及突變體二/三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，MEKK3K391M中激酶活性位點(diǎn)的改變影響了α-螺旋區(qū)和β-折疊在蛋白質(zhì)中的分布，同時(shí)該位點(diǎn)失去與化學(xué)物質(zhì)結(jié)合的能力。MEKK3蛋白K391突變?yōu)镸391，靠近反應(yīng)中心的原子側(cè)鏈占有的空間位置變大，增大了空間位阻，導(dǎo)致MEKK3與ATP結(jié)合的難度加大，從而無(wú)法呈遞磷酸基團(tuán)催化相應(yīng)的底物，MEKK3蛋白處于永久失活狀態(tài)。PROVEAN預(yù)測(cè)K391M的突變?yōu)橛泻ν蛔?。以上生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)表明突變后的MEKK3可能無(wú)法結(jié)合并催化相應(yīng)底物，失去生物學(xué)活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與MEKK3相互作用的蛋白質(zhì)大部分為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，結(jié)合生物信息學(xué)分析推測(cè)其主要作用方式是磷酸化并激活相應(yīng)蛋白底物，進(jìn)行信號(hào)傳遞。隨后，利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建了MEKK3突變體MEKK3K391M，MEKK3可以激活JNK，產(chǎn)生P-JNK，而MEKK3K391M無(wú)法激活JNK。為進(jìn)一步研究MEKK3在JNK通路中發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

作為一種蛋白激酶，MEKK3分子內(nèi)特殊位點(diǎn)的磷酸化是其行使功能的必要條件，大量研究證實(shí)，MEKK3存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。Thr294位點(diǎn)的磷酸化可使14-3-3蛋白與MEKK3相互作用，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活[12]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的刺激下，Ser526位點(diǎn)可被磷酸化，誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生[13]。Ser526是活化環(huán)內(nèi)一個(gè)自身磷酸化位點(diǎn)，其磷酸化作用可誘導(dǎo)NF-κB、ERK、JNK或p38的激活，而MEKK3K391M無(wú)法在此位點(diǎn)磷酸化，表明K391是MEKK3的活化關(guān)鍵位點(diǎn)[14]。在胚胎發(fā)育早期，內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換過(guò)程中MEKK3發(fā)揮了重要作用[15]，MEKK3K391M組間充質(zhì)細(xì)胞的生成減少。同時(shí)，在外植體中檢測(cè)到，MEKK3K391M組細(xì)胞凋亡蛋白比對(duì)照組高兩倍，表明MEKK3K391M可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAPK信號(hào)通路被認(rèn)為與炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡等生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)，帕金森氏病(PD)中，神經(jīng)炎癥發(fā)揮了重要的作用[16]，用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理BV2細(xì)胞，腦組織特異性表達(dá)的microRNA-124顯著下降，過(guò)表達(dá)microRNA-124，MEKK3/NF-κB信號(hào)通路被抑制，引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生[6]。在許多信號(hào)通路中，MEKK3可以與一些蛋白分子相互作用，形成復(fù)合體，在JNK信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。脂肪組織炎癥中，MEKK3與同樣具有PB1結(jié)構(gòu)域的蛋白NBR1之間的相互作用形成信號(hào)復(fù)合物，激活JNK[17]。MEKK3與WDR62形成復(fù)合物并將其磷酸化，激活JNK，控制神經(jīng)系統(tǒng)的生成[8]。MEKK3是IL-1R-TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路中MyD88-IRAK-TRAF6復(fù)合物的必須信號(hào)傳導(dǎo)，在IL-1和LPS刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生NF-κB、JNK。在MEKK3基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，Toll樣受體8(Toll-like receptor8，TLR8)介導(dǎo)的NF-κB、ERK、JNK的激活完全被阻斷[18]，因此TLR8激活JNK需依賴(lài)MEKK3的活化。然而在神經(jīng)損傷性疾病中，MEKK3激活JNK通路涉及眾多蛋白，其底物蛋白需要進(jìn)一步研究。

JNK作為炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)大腦中神經(jīng)元的凋亡或退化有重要影響[19]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，JNK被激活[20]，炎癥在缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，腦缺血時(shí)，受損血腦屏障內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞被激活。缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2表型的調(diào)控對(duì)腦修復(fù)至關(guān)重要。用脂多糖刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，茴香醇(對(duì)甲氧芐醇，PMBA)可通過(guò)抑制NF-κB激活和JNK的磷酸化抑制炎癥因子以及修復(fù)腦缺血的炎癥損傷[21]。蘆丁通過(guò)調(diào)節(jié)新生大鼠海馬JNK和p38 MAPK通路，減輕異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)凋亡[22]。JNK通路可以被許多蛋白分子調(diào)控，在阿爾茨海默氏癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，JNK和p38通路可被Cdk5/Rac1蛋白激酶復(fù)合體調(diào)控[23]。因此，尋找JNK上游調(diào)控因子，抑制JNK信號(hào)通路對(duì)于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。

4 結(jié)論

MEKK3中Lys391的氨基酸置換引起了蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，表現(xiàn)在α-螺旋、β-折疊的數(shù)量和位置變化、結(jié)合化學(xué)物質(zhì)和催化能力降低、側(cè)鏈基團(tuán)空間位阻變大等，突變蛋MEKK3K391M與ATP結(jié)合的難度加大，從而無(wú)法呈遞磷酸基團(tuán)催化相應(yīng)的底物，失去生物學(xué)活性，隨后的活性鑒定實(shí)驗(yàn)表明，野生型MEKK3可以激活JNK，而MEK-K3K391M不能。研究成果對(duì)于進(jìn)一步探索在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中與MEKK3相互作用的蛋白以及MEKK3如何調(diào)控JNK信號(hào)通路提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也將為神經(jīng)損傷性疾病的研究提供新的方向。