丹紅注射液聯合替羅非班對急性腦梗死患者NF-κB炎癥信號通路及療效的影響

康梅娟，溫昌明，劉義鋒，孫 軍，張保朝

(南陽市中心醫院，南陽 473000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是神經內科常見疾病，好發于中老年群體，多由于血栓形成或動脈壁上血栓脫落經血循環流入并阻塞腦動脈，導致相應部位供血、供氧不足或缺乏而誘發[1]。現階段，臨床治療ACI應在盡早恢復腦血管血流供應、減少腦組織梗死范圍的基礎上，關注缺血再灌注損傷、血栓再形成風險，以減少ACI的后遺癥或死亡率[2]。抗血小板聚集是現行治療ACI的主要方法之一，而《2018年美國急性缺血性卒中早期管理指南》修改抗血小板藥物替羅非班推薦級別為Ⅱb級，其不僅可抑制血小板聚集，還可阻止血栓形成、擴散[3]。丹紅注射液是一種經現代科技提取而成的中藥復方制劑，主要含有丹參酮、丹參酸及紅花黃色素、紅花酚苷等化學成分。有研究發現[4-5]，其可通過抗血栓形成、促進血管生成、制約氧化修飾、減輕局部炎癥級聯反應等多種機制和途徑發揮保護腦血管系統的作用。本研究就丹紅注射液聯合替羅非班治療ACI的效果以及可能作用機制進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月～2019年8月于我院收治的ACI患者125例，均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》中的ACI診斷標準[6]。納入標準：① 急性起病，且發病至入組時間<5 h。② TOAST分型為小動脈閉塞性卒中型及大動脈粥樣硬化性卒中型。③ 近期未輸血或接受抗凝藥或抗血小板藥治療。④ 入選患者均自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：① 近3個月有創傷史或行外科手術的患者。② 伴有急性、慢性感染或嚴重凝血功能障礙者。③ 患有其他嚴重疾病，如心力衰竭、肝腎功能不全等。④ 對丹紅注射液、替羅非班過敏或伴有影響藥物吸收疾病者。⑤ 臨床病歷資料不完整患者。

本研究經醫院倫理委員會批準，并按隨機數字表法將納入病例分為治療組(n=65)和對照組(n=60)。治療組男性37例、女性28例；年齡 40～81歲，平均年齡(55.42±5.99)歲；病程0.7～4.8 h，平均病程(3.19±0.88) h；體重指數(BMI)21.58～25.17 kg/m2，平均BMI(23.37±2.97) kg/m2；合并癥：既往高血壓40例，糖尿病25例；既往吸煙史34例，飲酒史31例。對照組男性35例、女性25例，年齡41～79歲；平均年齡(54.95±5.93)歲；病程0.6～4.9 h，平均病程(3.27±0.92) h；BMI 21.40～25.30 kg/m2，平均BMI(23.24±2.80) kg/m2；合并癥：既往高血壓37例，糖尿病23例；既往吸煙史32例，飲酒史28例。兩組基線資料無統計學差異(P>0.05)，具可比性。

1.2 給藥方法

兩組入院后經綠色通道盡快完成治療前相關檢查，合并高血壓、糖尿病等患者給予相應的對癥藥物治療，并根據病情控制血壓、血糖，維持水電解質、酸堿平衡，同時予依達拉奉(西安利君有限公司，國藥準字H20080495，批號：1911021，規格：20 ml∶30 mg)30 mg+100 ml 0.9%氯化鈉注射液靜脈滴注，bid，以清除自由基；予奧拉西坦注射液(河北醫科大學生物醫學工程中心，國藥準字H20174066，批號：190315，規格: 5 ml∶1.0 g)4.0 g+250 ml 0.9%氯化鈉注射液靜脈滴注，qd，以保護神經。在此基礎上，對照組予以鹽酸替羅非班(魯南制藥集團股份有限公司，國藥準字H20041164，批號：85191201，規格：100 ml∶5 mg)0.4 μg/(kg·min)，靜脈滴注30 min后，并以0.1 μg/(kg·min)的速度靜脈微泵替羅非班，持續1天。停用鹽酸替羅非班2 h前，口服硫酸氫氯吡格雷片(賽諾菲制藥有限公司，國藥準字H20123115，批號：181126，規格：75 mg/片)75 mg，1次/d；拜阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司，國藥準字J20171021，批號：BJ48737，規格:100 mg/片)100 mg/d，qd，并維持用藥2周。

治療組在對照組基礎上加予丹紅注射液(山東丹紅制藥有限公司，國藥準字Z20026866，批號：18101023，規格：10 ml/支)20 ml+0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，qd，持續治療2周。

1.3 觀察指標

1.3.1NF-κB p50和p65 mRNA

采用熒光定量PCR法檢測，即用Trizol試劑(上海聯邁生物工程有限公司，貨號LM-0010)提取血液中的總RNA，并參照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。據PCR試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司，貨號KM-90408)操作說明，以β-actin為內對照，并用同一樣品的cDNA和同樣的PCR反應條件進行NF-κB p50、p65的mRNA擴增。完畢后以Primer軟件設計引物，分析界面并計算樣品中目的基因mRNA的相對表達量，其中目的基因mRNA相對表達水平為2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 Real time-PCR引物序列及擴增產物長度

1.3.2NF-κB p50和p65蛋白

外周血加入200 μl紅細胞裂解試劑(北京博蕾德科技發展有限公司)，冰上放置30 min充分裂解細胞，3000 r/min離心10 min，收集上清為細胞裂解液。用Thermo Sdentific Pierce BCA蛋白檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進行蛋白定量，即為RIPA提取腦組織蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%)分離蛋白質樣品，上樣量為30 μg/孔，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，10%脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，然后加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗鼠或抗兔的二抗(上海研生生化試劑有限公司)室溫孵育過夜，ECL化學發光法顯色、定影。設β-actin為內參照基因，采用軟件對條帶進行半定量分析，測出各條帶IOD值，表示NF-κB p50、p65二者相對表達水平。

1.3.3炎癥反應指標

分別于治療前后，采集患者空腹外周靜脈血 6 ml，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑與靜脈血的比例為9∶1，輕輕充分混勻，以轉速3000 r/min離心6 min，取上清液于-20 ℃保存待測，采用ELISA檢測血清中白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

1.3.4療效判斷

采用日常生活活動(ADL)評分測評生活質量，分值范圍在0～100分，分值與生活質量呈正相關；采用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分測評患者的神經缺損情況，分值范圍在0～42分，分值與生活質量呈負相關。

1.3.5用藥安全性

觀察并記錄兩組患者治療期間出現與藥物相關的不良反應。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達

治療前，兩組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白無顯著差異(P>0.05)。治療后，兩組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白均下降，且治療組低于對照組(P<0.01)。見表2。

組別NF-κB p50NF-κB p65mRNA蛋白mRNA蛋白治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療組(n=65)2.07±0.511.00±0.201.95±0.520.92±0.183.20±0.681.88±0.223.24±0.701.90±0.21對照組(n=60)2.04±0.521.39±0.271.91±0.511.34±0.263.23±0.702.62±0.293.26±0.682.55±0.35t值0.339.120.4310.420.2415.970.1612.46P值0.750.000.670.000.810.000.870.00

2.2 炎癥反應指標

治療前，兩組的血清TNF-α、IL-8、IL-1β無統計學差異(P>0.05)。治療后，兩組的血清TNF-α、IL-8、IL-1β均下降，且治療組低于對照組(P<0.01)。見表3。

組別 TNF-α(ng/L)IL-8(pg/ml)IL-1β(ng/L)治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療組(n=65)30.50±5.2912.24±2.07349.47±38.92194.42±20.9020.16±4.617.52±2.31對照組(n=60)30.31±5.2219.50±3.26351.59±39.25237.72±28.5920.36±4.5912.34±3.60t值0.20114.730.309.600.248.83P值0.840.000.760.000.810.00

2.3 療效判斷

治療前，兩組的NHISS評分、ADL評分無顯著差異(P>0.05)。治療后，兩組的NHISS評分均下降，且治療組低于對照組(P<0.01)；兩組的ADL評分均上升，且治療組高于對照組(P<0.01)。見表4。

表4 兩組療效判斷比較 分

2.4 不良反應

125例患者全部完成試驗，無病死與脫失病例，且治療前后心電圖、生化檢查等未見顯著變化，無低灌注等情況發生。

3 討論

ACI多是供應腦部血液的動脈被粥樣硬化、血栓或栓子堵塞所致的嚴重腦組織軟化、壞死，在臨床上具有發病急、進展快、治療難度大等特點[7]。相關統計調查表明[8]，生活節奏加快、人口老齡化程度加重以及高脂飲食、運動減少等均導致ACI患病率逐漸升高，約有65%～70%的患者有再次發生急性腦血管事件的風險，具有更高的病死率。

既往研究發現[9]，NF-κB炎癥信號通路的激活是ACI發展的重要病理機制，其既可維持腦內環境的穩定，又可介導病原特異性應答。NF-κB屬NF-κB/Rel家族中的一員，正常生理條件下，NF-κB在細胞質中以p50/p65二聚體形式存在，并與其抑制蛋白IκB結合，滯留于細胞質中且無轉錄活性[10]。當炎癥反應發生時，腦組織內TNF-α、IL-1β等炎癥介質含量增多，可導致NF-κB的激活，而源于炎癥反應激活的NF-κB可刺激誘導炎癥因子、活性氧(ROS)等的產生，而二者又可反饋激活IκB激酶復合物IKKs，后者將三聚體p50/p65/IκB的IκB亞基調節位點的絲氨酸磷酸化，IκB蛋白從三聚體解離下來，使p50及p65暴露，繼而釋放p50/p65并發生核轉位與相應靶基因上的κB位點結合調節TNF-α、IL-8、IL-1β、Bcl-2等靶基因轉錄[11]。研究結果顯示[12]，TNF-α、IL-8、IL-1β水平隨缺血再灌注損傷病情進展不斷升高，形成“瀑布效應”，加重腦組織損傷。TNF-α是炎癥反應的觸發因子，能夠介導炎癥細胞發生聚集與黏附，同時促進巨噬細胞等合成并分泌大量IL-1β等二級炎癥因子，由此造成的炎癥級聯放大反應可造成遠隔組織的功能損傷，而后者又正反饋調節NF-κB的激活，刺激多種凋亡相關基因的表達并造成神經元細胞凋亡，形成惡性循環[13]。IL-8多由于NF-κB過度表達所激活和釋放，其可結合趨化因子受體IL-8受體α，誘導釋放大量蛋白酶直接損傷腦組織，促進后續一系列病理生理級聯反應，對細胞及缺血組織損傷加劇[14]。由此可見，ACI患者長期處于一種炎性損害循環中，而若ACI患者本身合并有高血壓、糖尿病等慢性炎癥疾病，NF-κB誘導的炎癥反應對其影響更為嚴重，因此探究NF-κB的調控機制至關重要[15]。本研究結果可見，治療組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達以及炎癥反應指標TNF-α、IL-8、IL-1β水平均低于對照組。提示丹紅注射液輔助治療能夠抑制NF-κB炎癥信號通路的激活和炎癥因子的釋放，這可能是該方案改善患者腦組織損傷、神經細胞凋亡的重要因素之一。

既往文獻指出[16]，對于ACI患者而言，生理、生活質量的綜合康復在推動患者回歸社會進程中起重要作用，因此，為更準確地提供上述領域細節上的信息，本研究采用ADL評分、NHISS評分進行評估。結果顯示，經治療干預后治療組ADL評分高于對照組，NHISS評分低于對照組。提示丹紅注射液聯合替羅非班較單一應用替羅非班更能夠有效減輕患者腦損傷程度，改善其神經功能及生活質量，治療效果確切。分析原因可能是丹紅注射液聯合替羅非班均具有抗血小板作用，可發揮一定協同作用，促使血管舒張，增加血管通透性。同時，丹紅注射液亦可激活內皮細胞功能、抑制動脈硬化進程，以恢復血腦屏障正常結構并改善腦內供血和供氧，保護腦組織內環境[9]，進而達到治療目的。

綜上，丹紅注射液聯合替羅非班治療ACI能進一步改善患者預后，其機制可能與抑制NF-κB炎癥信號通路的活化及炎癥因子釋放有關。然而，本研究時間較短，可能對研究結果可信度造成一定影響，此為不足之處，因此該方案的中長期療效尚有待更長期的大樣本研究加以證實。