苯磺貝他斯汀片中基因毒性雜質苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯的含量測定

舒理建 樓賽麗 吳晨皓 盧鑫鑫 邵旭民（浙江普洛康裕制藥有限公司，浙江 東陽322118）

苯磺貝他斯汀是非鎮靜類高選擇性組胺受體拮抗劑，對肥大細胞具有穩定作用，能夠阻止嗜酸性粒細胞遷移至炎癥組織，并可抑制白細胞介素-5、白三烯B4（LTB4）和血小板活化因子（PAF），減輕過敏炎癥，是一種高效的抗過敏藥物，不良反應較輕微。[1-3]苯磺貝他斯汀的合成過程中采用了乙醇和異丙醇，易與苯磺酸反應生成苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯。兩者為基因毒性雜質，人用藥物注冊技術要求國際協調會議（ICH）于2014年發布M7（基因毒性雜質指南）。指南中對基因毒性雜質限度計算做了指導，計算得出苯磺貝他斯汀中含苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的限度均為75 ppm。歐洲藥典采用液相質譜聯用法進行苯磺酸乙酯含量測定，但儀器昂貴，在藥企不能廣泛適用。所以，建立了該方法并做了方法學驗證。

1 儀器與材料

1260 高效液相色譜儀（紫外檢測器，美國Agilent 公司）；MILLIPOR超純水機（德國默克公司）；DK-360HTD超聲清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司）；XS105十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。乙腈（色譜純，德國merck公司）；磷酸（色譜純，德國CNW公司）。苯磺貝他斯汀片（日本田邊三菱制藥株式會社）；苯磺酸乙酯對照品（TCI 公司）；苯磺酸異丙酯對照品（自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ACE 3 C8色譜柱(150*4.6 mm，3 um)；流動相為乙腈—0.1%磷酸水溶液=1：3，等度洗脫；檢測波長為220 nm；流速為0.9 ml×min-1；柱溫30 ℃；進樣量為20 ul。

2.2 溶液的配制

空白溶劑（稀釋劑）： 取乙腈和水，以95：5比例混合，即得。

苯磺酸乙酯對照品儲備液的配制：精密稱取苯磺酸乙酯約144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻；另精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得苯磺酸乙酯對照品儲備液。

苯磺酸異丙酯對照品儲備液的制備：精密稱取苯磺酸異丙酯144 mg，置50 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻；另精密量取此溶液1 ml 置于100 ml 量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，得苯磺酸異丙酯對照品儲備液。

對照溶液配制：分別精密量取苯磺酸乙酯對照品儲備液1ml和苯磺酸異丙酯對照品儲備液1 ml，置同一10 ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統適用性溶液：即對照溶液。

供試品溶液配制：苯磺貝他斯汀片研磨成均勻粉末，取約0.32 g，精密稱定，置10 ml 量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統適用性試驗

在上述色譜條件下，取苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯對照溶液重復進樣6次，峰面積的RSD 分別為1.20%和1.45%，均小于2.0%。

2.4 專屬性試驗

取苯磺貝他斯汀片粉末約0.32 g，精密稱定，置10 ml 量瓶中，用少許稀釋劑溶解，加入1 ml 苯磺酸乙酯儲備液和1 ml 苯磺酸異丙酯儲備液，用稀釋劑稀釋之刻度，搖勻，進樣。結果表明其他未知雜質與苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 檢測限與定量限

分別精密量取苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯對照品儲備液適量，采用逐步稀釋法進行檢測限與定量限測定。在220 nm的檢測波長下，信噪比＞3時的濃度為檢測限，信噪比＞10時的濃度為定量限。苯磺酸乙酯的檢測限和定量限分別為0.000032 mg×ml-1（信噪比為3.6）和0.00032 mg×ml-1（信噪比為22.2）。苯磺酸異丙酯的檢測限和定量限分別為0.000064 mg×ml-1（信噪比為6.5）和0.00032 mg×ml-1（信噪比為14.4）。在定量限濃度下，樣品重復進樣6 次，苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的峰面積RSD分別為2.55%和2.42%，均滿足測定要求。

2.6 線性范圍

取苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯對照品儲備液，分別精密量取 適 量，配 制 成0.00032，0.00064，0.00096，0.00192，0.0024，0.00288 mg×ml-1的系列標準溶液。在220 nm 的檢測波長下進樣分析，以濃度（C，mg×ml-1）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行回歸線性分析，苯磺酸乙酯的線性方程為A=24327C+0.4199，相關系數r 為0.9989，苯磺酸異丙酯的線性方程為A=19830C+1.7887，相關系數r，0.9986，說明苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯的峰面積與其濃度在0.00032 mg×ml-1-0.00288 mg×ml-1內線性關系良好。

2.7 加標回收率試驗

在苯磺貝他斯汀片中分別加入80%限度，100%限度，120%限度三個水平的各組分三份，計算各組分的加樣回收率，見表1和表2，苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯回收率在93.0%-102.2%之間，結果說明方法的準確度良好。

表1 苯磺酸乙酯加樣回收率測定結果

表2 苯磺酸異丙酯加樣回收率測定結果

3 結語

建立了苯磺貝他斯汀片中對基因毒性雜質苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯的HPLC方法。結果顯示，該方法的專屬性良好，檢測限較低[4]，線性關系和回收率均良好，能夠滿足類該基因毒性雜質的分析要求。與HPLC-MS和HPLC-MS/MS比較，HPLC在制藥企業的日常檢測中更適用、更廣泛，值得推廣應用。