蒙醫“蒜變劑”瀉藥抑制II型糖尿病腎病小鼠微炎癥的研究

鋼更 郭瑞敏 薩如拉 溫都蘇畢力格 梅榮 白黑小 張全

摘 要：目的：探討蒙醫“蒜變劑”瀉藥對II型糖尿病腎病小鼠微炎癥的抑制及腎功能改善.方法：將實驗動物隨機分為正常組、II型糖尿病腎病模型組、陽性對照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組，通過檢測尿微量白蛋白和熒光探針標記技術觀察各組動物腎小球濾過率情況，制備病理組織切片HE染色觀察動物組織病理結構改變，運用透射電鏡技術觀察腎臟超微結構改變.結果：60mg/kg蒙醫“蒜變劑”瀉藥可顯著提高II型糖尿病腎病小鼠的腎小球濾過率，修復腎小球基底膜功能，抑制腎間質纖維化，抑制腎小管上皮細胞足細胞廣泛融合或丟失，降低電子致密物堆積.結論：蒙醫“蒜變劑”瀉藥可有效抑制II型糖尿病腎病小鼠微炎癥.

關鍵詞：II型糖尿病腎病;蒙醫蒜變劑瀉藥;微炎癥

中圖分類號：R291.2;R781.6+4? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）05-0030-05

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD），是1型和2型糖尿病（T1DM和T2DM）患者的一種嚴重并發癥[1].糖尿病的流行已達到流行病的程度，并在全球范圍內繼續迅速增加，預計到2040年這一數字將上升到6.42億.雖然T1DM和T2DM的患病率都在增加，但最顯著的增加是在T2DM患者中.糖尿病對健康有實質性的影響，并且個人和社會要為此承受巨大的經濟負擔[2]，雖然一些現有的治療干預可以延遲糖尿病腎病的發病和進展，但糖尿病腎病的發病率仍然很高，需要新的治療方法.

DN特征是血壓逐漸升高，腎小球濾過率下降，為高風險心血管事件[3].DN的發病機制非常復雜.持續性蛋白尿是糖尿病腎病的標志，故其傳統診斷上以微量蛋白尿為基礎[1].腎小球濾過率（GFR）是腎功能評估的金標準，用于確定腎臟疾病的進展和藥物誘導的腎臟毒性.評估GFR最常用的方法之一是測量血液中被標記菊粉的消失速率;由于菊粉在腎臟腎小球中被完全過濾（既不分泌也不被小管吸收），所以其消失率與GFR成正比.DN的病理變化主要有：腎小球系膜區基質增多，腎小球基底膜（glomerular basement membranes，GBM）增厚，彌漫性或結節性硬化，細動脈較明顯玻璃樣變性，部分病例標本在毛細血管壁有細線狀IgG沉積，腎小管較突出的病理變化是上皮細胞泡沫狀改變.透射電鏡超微結構病變特點有：GBM不同程度均質性增厚，系膜基質增多，可見足突細胞融合，無電子致密物沉積和細胞增生性改變[4，5]，當機體發生腎小球腎炎時常常伴有電子致密物沉積和細胞增生性改變[6].

經典蒙醫“蒜變劑”瀉藥以大蒜、金柯子、肉蔻、紅花、巴豆、冰片、牛奶等組成的制劑，取后以水煎、過濾、濃縮而成.在臨床上治療腎病綜合征局灶性病變、微小病變型腎病有著確切療效[7，8].本研究試圖探討該藥劑對小鼠II型糖尿病腎病的治療效果，并對其分子機制進行初步研究.

1 材料

1.1 實驗動物

購買7-8周齡雄性35只小鼠，其中db/m小鼠5只，II型糖尿病db/db小鼠30只（北京大學醫學部）.將小鼠飼養于溫度22～25℃、濕度65%的飼養室內，晝夜輪替交換光照12h.

1.2 藥物及試劑

藥物成分：蒙醫“蒜變劑瀉藥”是以大蒜、金柯子、肉蔻、紅花、巴豆、冰片、牛奶等組成.制作方法，水煎、過濾、濃縮至2.5g/mL，裝入瓶中待用.

實驗試劑：熒光探針GFR-Vivo 680（PerkinElmer，NEV30000），4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司），2.5%戊二醛固定液（SPI，100703），蘇木素伊紅染色液（雷根生物，DH0006），812包埋劑（SPI，90529-77-4）.

1.3 主要儀器

活體近紅外光學成像系統（SWIR 1.0），全自動生化分析儀（日本日立公司，7020），脫水機（武漢俊杰電子有限公司，JJ-12），包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）普通光學顯微鏡（Leica，NikonEclipseTi-SR），超薄切片機（Leica，UC7），鉆石切片刀（Daitome，Ultra 45°），透射電子顯微鏡（FEI公司，TECNAI G 20 TWIN）.

2 方法

2.1 模型建立

在動物房適應飼養1周后，用0.6%戊巴比妥鈉按照10ml/kg劑量按體重進行腹腔注射麻醉，去除背部毛發，小鼠俯臥，綁定小鼠四肢，用75%酒精涂抹裸露皮膚處后，涂碘伏消毒，找出腎的大約位置，切開皮膚及肌肉層約1cm，翻開腎周脂肪，找出左側腎動脈和靜脈及輸尿管進行結扎，然后切除腎臟，依次縫合肌肉層和皮膚，再次消毒，將小鼠放入籠子，待清醒，術后將小鼠單獨飼養，術后3d內每天腹腔注射抗生素預防感染.

2.2 藥物干預

糖尿病腎病小鼠模型建立成功后，將動物隨機分為正常對照組、II型糖尿病組、II型糖尿病腎病組、強的松組、蒙醫“蒜變劑”瀉藥低劑量組（L），蒙醫“蒜變劑”瀉藥中劑量組（M），蒙醫“蒜變劑”瀉藥高劑量組（H），強的松組、蒙醫“蒜變劑”瀉藥組（L），蒙醫“蒜變劑”瀉藥組（M），蒙醫“蒜變劑”瀉藥組（H）分別給予30mg/kg強的松、30mg/kg蒙醫“蒜變劑”瀉藥、60mg/kg蒙醫“蒜變劑”瀉藥、90mg/kg蒙醫“蒜變劑”瀉藥，正常對照組、II型糖尿病組和II型糖尿病腎病組分別灌胃給予等量的生理鹽水，每組5只，每天固定時間灌胃一次，連續給藥7天.

2.3 檢測指標

2.3.1 尿微量白蛋白（mAlb）檢測

分別于干預第3、6天將鼠放入小鼠代謝籠，收集動物尿液，用比色法測定小鼠24h尿微量白蛋白.

2.3.2 腎小球濾過率檢測

每組小鼠連續給藥7d后，尾靜注射2nmol熒光探針GFR-Vivo 680（溶于100μL無菌PBS中），45min后于活體近紅外光學成像系統680nm熒光波長下檢測信號，觀察并比較不同處理組熒光變化情況.

2.3.3 HE染色觀察病理變化

取腎臟組織，4%多聚甲醛固定48h，水洗過夜，梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4μm厚的石蠟切片，行HE染色，用光學顯微鏡在20倍物鏡下觀察拍照.

2.3.4 透射電鏡觀察腎組織形態學變化

將切好的腎臟組織置于2.5%的戊二醛固定液中4℃過夜，再用1%鋨酸磷酸緩沖液室溫固定2h，梯度酒精脫水，依次經丙酮：環氧樹脂（2：1）、丙酮：環氧樹脂（1：1）、環氧樹脂滲透，37℃溫箱內，每次滲透8～12小時，之后用環氧樹脂包埋，60℃溫箱中聚合48小時，超薄切片機切片80nm厚，鈾鉛雙染色，室溫干燥，電鏡下觀察、拍照.

3 統計學方法

實驗數據以x±s表示，應用統計分析軟件SPSS22.0對變量型實驗數據進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，經bonferroni校正，事后檢驗，進行兩兩多重比較，顯著水平α=0.05，置信區間為95%，當分析結果P<0.05時，差異具有統計學意義.

4 結果

4.1 mAlb變化

各組動物mAlb結果如表1所示.與正常組比較，DN組的mAlb明顯升高，且差異具有顯著性（P =0.0001）;高劑量組與DN組比較，mAlb明顯降低，差異顯著，具有統計學意義（P<0.0001）.

4.2 GFR變化

各組動物GFR變化情況如圖1所示.正常組和T2DM小鼠腎小球濾過功能完全正常，而DN組GFR卻顯著下降，陽性對照強的松組較DN組改善顯著，蒙醫“蒜變劑”瀉藥低劑量組效果較差，中劑量組所有緩解，高劑量組效果最好.說明該藥物可以修復腎小球基底膜，改善腎小球滲透濾過功能.

4.3 病理組織形態變化

各組動物腎臟病理結構變化如圖2所示.與正常組比較，T2DM組腎小管可見明顯擴張，明顯管狀緣脫落，部分腎小球可見明顯萎縮壞死，組織未見明顯炎癥細胞浸潤;DN組腎小管可見明顯擴張及明顯管狀緣脫落，組織可見少量炎癥細胞浸潤;強的松組腎小管可見輕微擴張，明顯管狀緣脫落，腎小球結構清晰可見，部分腎小球可見明顯萎縮，組織未見明顯炎癥細胞浸潤;高劑量組腎小管上皮細胞未見明顯脫落水腫壞死，腎小球結構清晰可見，未見腎小球明顯腫脹萎縮，組織未見明顯炎癥細胞浸潤.由此可見，蒙醫“蒜變劑”瀉藥對DN有顯著的病理改善作用.

4.4 腎臟組織超微結構變化

各組小鼠腎臟組織超微結構變化如圖2所示.正常組腎小球整體結構正常，GBM系膜未見明顯增厚，臟層上皮細胞足突排列整齊，未見彌漫性融合，系膜區未見明顯電子致密物沉積.與正常組比較，TADM組GBM可見少量電子致密物堆積，組織可見系膜細胞，足細胞明顯異常增生.DN組腎小球整體結構異常，臟層上皮細胞內細胞器排列紊亂，可見大量線粒體脊斷裂，GBM可見明顯增厚，足突可見彌漫性融合，GBM可見明顯電子致密物沉積.強的松組腎小球整體結構基本正常，GBM系膜未見明顯增厚，臟層上皮細胞足突排列較整齊數量較多，未見明顯融合，但基底膜可見明顯電子致密物堆積.高劑量組腎小球整體結構基本正常，GBM系膜未見明顯增厚，臟層上皮細胞足突排列整齊，足細胞足突良好，未見彌漫性融合GBM可見明少量電子致密物沉積，而中劑量和低劑量組效果稍差.由此可見，該藥物不僅對腎病綜合征有良好效果，在炎癥抑制方面也有強大作用.

5 討論

據統計，大約30-40%患者的糖尿病會發展為腎病.糖尿病腎病（DN）的發病原因非常復雜.DN是最常見的慢性腎臟疾病，是終末期腎臟疾病的主要病因.慢性糖尿病的發生與機體代謝及血流動力學壓力等有關，這些壓力可促進DNA、蛋白質和脂質的改變，誘導細胞產生功能障礙，從而促進機體炎癥和纖維化的發生，導致各種類型的腎損傷.大量實驗和臨床研究證據表明，腎臟炎癥在糖尿病患者腎損傷進展中具有決定性作用[9].

DN與全身性和局部性腎臟炎癥有關.隨著疾病的發展，在早期糖尿病腎病患者機體血清或外周血中檢測到的炎性細胞因子（如白細胞介素IL-1β、IL-6，腫瘤壞死因子TNF-α，單核細胞趨化因子蛋白MCP-1，巨噬細胞炎性蛋白MIP-1β）和免疫調節因子（如粒細胞單核細胞集落刺激因子GM-CSF，胞內粘附因子ICAM-1，髓樣分化因子MyD88）水平顯著升高[10].此外，糖尿病患者腎活檢的組織學分析表明，糖尿病腎病是由三種腎小球病變構成的：腎小球基底膜增厚、腎小球系膜擴張和小動脈玻璃樣變性[11].腎小球硬化的進展是糖尿病腎病的主要組織學特征，其他組織學特征包括足細胞脫離腎小球基底膜、足細胞丟失、腎小球小管連接異常、腎小球數目減少、腎小球肥大、腎小管萎縮和間質纖維化，其中，足細胞丟失與2型糖尿病患者蛋白尿水平密切相關，腎小球數量降低和腎間質纖維化與腎小球濾過率下降密切相關[9].腎活檢分析顯示，糖尿病腎病的腎小球和間質均存在炎癥細胞，并與腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化相關[12，13].

DN是2型糖尿病（T2D）的主要并發癥，是決定糖尿病患者死亡率的關鍵因素.開發既能控制T2D又能預防DN發展的新型治療藥物具有重要意義[14].民族傳統醫學根植于各民族傳統文化土壤，幾千年來形成了豐富的診斷和醫療系統，積累了豐富的臨床經驗，具有獨特的醫藥理論體系.民族藥是中國民族傳統醫藥的重要組成部分，在我國少數民族地區甚至全國的現代醫療體系中發揮著重要作用[15，16].在蒙醫臨床用藥中發現，蒙醫“蒜變劑”瀉藥對腎病相關疾病有著良好的預后和奇特功效.本文研究結果看出，糖尿病腎病小鼠口服90mg/kg蒙醫“蒜變劑”瀉藥，可以促進腎小球基底膜修復，提升腎小球濾過率，降低尿液中微量白蛋白水平，抑制腎小球炎癥發生和腎間質纖維化過程.初步判斷，該藥物是通過抑制機體腎臟炎癥來發揮其作用，但具體作用的蒙藥藥物成分和機理還不清楚，需進一步深入研究探討.

——————————

參考文獻：

〔1〕Papadopoulou-Marketou N.， Kanaka-Gantenbein C.， Marketos N.， et al. Biomarkers of diabetic nephropathy： A 2017 update [J]. Crit Rev Clin Lab Sci， 2017， 54（5）： 326-42.10.1080/10408363.2017.1377682.

〔2〕Flyvbjerg A. The role of the complement system in diabetic nephropathy [J]. Nat Rev Nephrol， 2017， 13（5）： 311-8.10.1038/nrneph.2017.31.

〔3〕Parving H. H.， Persson F.， Lewis J. B.， et al. Aliskiren combined with losartan in type 2 diabetes and nephropathy [J]. N Engl J Med， 2008， 358（23）： 2433-46.10.1056/NEJMoa07 08379

〔4〕劉曉丹，楊剛，范秋靈，et al.自發性2型糖尿病動物模型KKAy小鼠腎臟損害的特征與演變%Renal Impairment in KKAy Mice with Spontaneous Type 2 Diabetes[J]. 中國醫科大學學報， 2011，040（2）：104-6.

〔5〕于琳華，任淑婷，李恒力，et al.糖尿病性腎損害發病機制的病理學證據%Pathological evdence for pathogenesis of renal damage in diabetes mellitus[J].中國組織工程研究，2004， 008（12）：2274-5.

〔6〕曲利娟，余英豪，余毅，et al.電子致密物沉積病的超微結構觀察%Ultrastructural observation of dense deposit disease[J].電子顯微學報，2002，021（6）：879-84.

〔7〕貴其德，天亮，王青春.蒙醫“蒜變劑瀉藥”對大鼠阿霉素致微小病變腎病綜合征模型的影響[J].北方藥學，2013（04）：63-4.

〔8〕張全，薩如拉，王青春.蒙醫蒜變劑瀉藥對阿霉素致大鼠腎病綜合征模型局灶性病變的影響[J].中國民族醫藥雜志，2018（8）：51-3.

〔9〕Tesch G. H. Diabetic nephropathy - is this an immune disorder？ [J]. Clin Sci （Lond）， 2017， 131（16）： 2183-99.10.1042/cs20160636.

〔10〕Perlman A. S.， Chevalier J. M.， Wilkinson P.， et al. Serum Inflammatory and Immune Mediators Are Elevated in Early Stage Diabetic Nephropathy [J]. Ann Clin Lab Sci， 2015， 45（3）： 256-63.

〔11〕Tervaert T. W.， Mooyaart A. L.， Amann K.， et al. Pathologic classification of diabetic nephropathy [J]. J Am Soc Nephrol， 2010， 21（4）： 556-63.10.1681/asn.2010010010.

〔12〕Nguyen D.， Ping F.， Mu W.， et al. Macrophage accumulation in human progressive diabetic nephropathy [J]. Nephrology （Carlton）， 2006， 11（3）： 226-31.10.1111/j.1440-1797.2006.00576.x.

〔13〕Klessens C. Q. F.， Zandbergen M.， Wolterbeek R.， et al. Macrophages in diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes [J]. Nephrol Dial Transplant， 2017， 32（8）： 1322-9.10.1093/ndt/gfw260.

〔14〕Deng X.， Sun L.， Lai X.， et al. Tea Polypeptide Ameliorates Diabetic Nephropathy through RAGE and NF-κB Signaling Pathway in Type 2 Diabetes Mice [J]. J Agric Food Chem， 2018， 66（45）： 11957-67.10.1021/acs.jafc.8b04819.

〔15〕朱根華，熊耀坤，鐘國躍.少數民族醫藥產業發展面臨的困境及改革策略研究——以蒙、藏、維民族醫藥為例[J].西南民族大學學報（人文社科版），2015（8）：154-8.

〔16〕金丹鳳.少數民族醫藥的發展前景分析[J].藥品評價，2006（02）：20-2.