GC-MS/MS-SRM 技術在檢測白酒中5種吡嗪類化合物的應用研究

李正濤 ，孫 躍，孫海燕，錢 宇，趙金松，，黃志久，李 丹

（1.四川輕化工大學，四川宜賓 644000；2.瀘州老窖集團有限責任公司，四川瀘州 646000）

吡嗪是1,4 位含氮的六元雜環化合物，其衍生物廣泛存在于天然和發酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣[1]，由于它們具有極低的風味閾值，還對其他香味物質有明顯的烘托作用，可使白酒的香氣更為豐滿，對白酒風味有重要貢獻[2]。同時,吡嗪類物質也是白酒中一類功能性化合物。有研究表明，吡嗪類化合物具有擴張血管、促進血循環、改善學習障礙、護肝等功能[3]，因此成為近年來白酒養生系列的一個研究熱點。目前，白酒中吡嗪類化合物的測定方法主要有頂空固相微萃取、液-液萃取等結合氣相色譜FID 檢測器、NPD 檢測器及質譜的測定[4-5]，或者利用液相色譜-質譜聯用法進行測定[6]。王莉等[7]建立了一種利用氣質聯用的選擇離子模式進行分析，直接進樣定量白酒中4 種重要吡嗪化合物的方法。該方法直接進樣，簡單、便捷，但具有較高的檢出限，比較適合于檢測白酒中含量較高的幾種吡嗪，另外，雖然SIM 靈敏度和抗干擾力比SCAN 強，但是SIM 是單離子監測，即只掃描一個離子，相比于SRM，分辨率低，抗背景干擾能力更弱。王柏文等[8]采用頂空固相微萃取結合GC/NPD 技術分析芝麻香型白酒中含氮化合物，結果定性檢測到10 種具有風味特征的吡嗪類化合物。這種方法利用液液萃取對樣品進行了一定的濃縮，有效提高了儀器對吡嗪類物質的檢出，但是整個前處理過程較為復雜，需要經過多次樣品轉移，因此會使目標化合物有一定的損失，影響定量的準確性。氣相色譜－四級桿串聯質譜是目前檢測機構及白酒企業廣泛應用的檢驗設備。

SRM(selected reaction monitoring)是基于質譜的選擇反應監測技術，對質譜數據進行過濾，在母離子中選擇符合條件的母離子，進行破碎后形成子離子，在多個子離子中選出符合條件的子離子，經過兩次的選擇，得到每個物質的母離子和子離子對，有效去除了噪聲干擾，因此SRM 模式具有更高的檢測范圍和靈敏度，更適用于復雜樣品混合物的檢測，相對于傳統的質譜技術更具優勢[9]。現階段，SRM 模式在蛋白質組學[9]、毒藥和藥品[10]、農殘[11]、尿檢[12]等領域應用廣泛，在白酒中應用相對較少，相關文獻報道較少。本研究采用氣相串聯質譜中的選擇反應檢測掃描（SRM），建立了一種簡單、快速、經濟的白酒中5種吡嗪化合物的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市購的16 種成品酒，編號為C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14、C-15、C-16，見表1。

標樣：2-甲基吡嗪（純度≥98%）、2,5-二甲基吡嗪（純度≥98%）購自北京百靈威科技有限公司；2,3,5-三甲基吡嗪（純度≥98%）、2,3-二乙基吡嗪（純度≥98%）購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；2,3,5,6-四甲基吡嗪購自南京化學試劑股份有限公司。

表1 采集樣品信息

試劑：色譜級乙醇購于ANPEL 公司。

吡嗪標準貯備液：分別稱取一定量的5 種標準品（精確至0.0001 g）,用60%vol 的乙醇溶解并定容，配制成濃度為1 g/L的標準儲備液。

吡嗪混合標準應用液：根據相關學者對白酒中吡嗪類化合物的研究[5，13-15]，分別從吡嗪標準貯備液中取一定的量到100 mL 容量瓶中，用60%vol 的乙醇稀釋并定容，使2-甲基吡嗪濃度為1 mg/L，2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪濃度為2 mg/L，2,3,5-三甲基吡嗪濃度為4 mg/L，2,3,5,6-四甲基吡嗪濃度為10 mg/L。以此為標準曲線最高濃度點，再逐級稀釋4 個梯度，即2-甲基吡嗪為0.0625 mg/L、0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L 和1.000 mg/L；2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪為0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L、1.000 mg/L 和2.000 mg/L；2,3,5-三甲基吡嗪為0.250mg/L、0.500mg/L、1.000mg/L、2.000 mg/L、4.000 mg/L；2,3,5,6-四甲基吡嗪為0.625 mg/L、1.250 mg/L、2.500 mg/L、5.000 mg/L 和10.000 mg/L。使用以上5個梯度繪制標準曲線。

儀器設備：氣相串聯質譜儀（TRACE 1300-TSQ8000），自動進樣器（AI/AS 1310）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；色譜柱為HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μ m）：安捷倫科技有限公司；電子天平購自上海恒剛儀器儀表有限公司，高純氦氣（99.999%）、高純氬氣：南京特種氣體有限公司。

1.2 試驗方法

氣相色譜（GC）條件：起始溫度為50 ℃，保留1 min，以10 ℃/min的速率升至70 ℃，再以5 ℃/min的速率升至100 ℃，再以50 ℃/min 升至250 ℃；進樣口溫度為230 ℃，恒流模式，流速為1 mL/min，分離比為20∶1；進樣量為1 μL。

質譜（MS）條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度260 ℃；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲3 min，選擇反應檢測掃描模式（SRM），離子掃描參數見表2。

表2 5種吡嗪化合物的質譜參數

2 結果與討論

2.1 進樣方式

本研究的樣品皆為市購成品白酒，在相關學者的大量研究中，對于白酒中吡嗪類化合物的檢測，較多使用了前處理，比如頂空固相微萃取[14]、液液萃取[15]、旋轉蒸發濃縮[16]等。各種前處理方法，雖然對白酒中風味化合物有一定的濃縮作用，但是在前處理過程中，也會損失一部分目標化合物，且耗費時間相對較長，部分前處理方式所使用的儀器價格也比較昂貴。在本研究中使用的SRM 模式，質譜圖中只會出現目標化合物，本研究中采用直接進樣的方式，相對于進行前處理，此方式操作簡單，經濟實惠，也不需要使用有機試劑，既大大的縮短了時間，又使目標化合物保留更充分，降低了目標化合物的損失。

2.2 氣相串聯質譜不同模式對比

使用同一個樣品分別進行SCAN 模式，SIM 模式和SRM 模式3 種不同質譜模式檢測，其中從SCAN 模式的質譜圖（圖1）可以看出，樣品的全掃描質譜圖中，由于存在很多含量相對比較低的風味物質，圖形中含量比較低的物質分離效果并不好,很多物質的圖形是連在一起的,而且雜峰比較多，該種模式不太適合用于檢測含量比較低的風味物質,通常全掃描模式用于定性分析。SIM 模式是選擇離子掃描模式，用該模式檢測樣品時，圖形中只會出現擁有事先輸入碎片離子的化合物峰，如圖2所示，圖形中雜峰相對于全掃描模式要少很多，雖然這種模式相對于全掃描模式有一定的選擇性，但是在這種模式下，仍然會出現一些含有特征離子的非目標化合物峰，SIM 模式用于定量檢測微量化合物，必須要找出獨特的離子碎片，否則會出現一些干擾性雜峰，因此SIM 模式在專一性上存在一定的缺陷。SRM 模式是選擇反應監測模式（圖3），從圖3 可看出，圖形中只有目標化合物峰，沒有其他雜峰，在這種模式下，無論目標化合物的含量是相對比較低還是較高，圖形中只會出現目標化合物，選擇性非常高，而且在目標峰能夠分離的情況下，該種模式可以盡可能的縮短檢測時間，有利于建立一種快速檢測方法，適合于微量化合物的定量檢測分析。綜上所述，SRM 模式相對于另外兩種模式,具有更強的抗噪音干擾能力,更強的靈敏度,更高的準確性,因此本研究采用選擇反應檢測掃描模式（SRM模式）對樣品進行定量分析檢測。

2.3 質譜SRM的優化

使用直接進樣分析目標化合物的混合標準使用液，對5 種吡嗪類化合物進行質譜全掃描分析。首先根據總離子圖確定5 種吡嗪化合物的出峰時間，在SRM 優化過程中，5 種吡嗪化合物進入一級質譜后，通過每種化合物的出峰時間找出對應化合物，確定其對應母離子，母離子進入二級質譜，對過濾后的母離子進行碎裂，確定母離子對應的最優子離子；母離子與子離子對確定后，對化合物母離子逐一施加一定步長的碰撞能量（CE），確定母離子與子離子對的最佳碰撞能（EC）。每個目標化合物選取2 對最具特征且響應最高的SRM 離子及相應的儀器參數作為最終的質譜采集參數（見表2）。

表3 5種吡嗪類化合物的保留時間、線性回歸方程、線性范圍及相關系數

2.4 標準曲線、精密度及檢測限

將配制好的標準溶液分別按照上述條件進行檢測分析，得到5 種吡嗪類化合物的標準曲線線性方程，其線性回歸方程、線性范圍和相關系數見表3。在酒精濃度為60%vol 的乙醇水溶液中添加混合標準溶液，使5 種吡嗪類標樣濃度均為50 μg/L，在相同的條件下連續檢測6 次，以信噪比S/N=3 確定方法檢出限（limit of detection，LOD）[14]；根據5種吡嗪在白酒中含量不同,酒樣中加入不同濃度的吡嗪標液進行加標回收率試驗,其中2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪分別添加0.125 mg/L、0.5 mg/L、1.25 mg/L；2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪分別添加0.25 mg/L，每個添加水平分別做6 個平行樣品，利用6 個平行樣品的實驗數據計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），即為該方法的精密度，結果見表3。

由表3 可知，5 種標準物質在相應的線性范圍內，線性關系良好，相關系數都在0.99以上。由表4可知，回收率在98.52%～103.46%，相對標準偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法檢出限（LOD，S/N＝3）在10～14 μg/L，樣品的加標回收率較高，說明本方法在檢測過程中，目標物質損失較少；相對標準偏差值較低，精確度高；具有較低的方法檢出限，滿足白酒中吡嗪類痕量物質檢測的實驗要求。

表4 回收率、相對標準偏差及檢出限

2.5 樣品分析

按照試驗方法定量分析16 種市購成品白酒,其5 種吡嗪類化合物的含量如表5。由表5 可知，在這16 種酒樣中，都檢測出了這5 種吡嗪類化合物，每種酒樣的四甲基吡嗪含量都要明顯高于其他4 種吡嗪類化合物，說明在這5 種吡嗪類化合物中，四甲基吡嗪可能占據著主導地位；醬香型白酒中，僅次于四甲基吡嗪含量的是2,3,5-三甲基吡嗪；然而在濃香型、兼香型和芝麻香型白酒中，僅次于四甲基吡嗪的含量為2,3-二乙基吡嗪，居于第二位；除醬香型外，另外3種香型白酒中，2-甲基吡嗪在5種吡嗪中含量最低。從檢測的所有樣品來看，對于這5 種吡嗪類化合物的總含量，醬香型白酒中含量最高，其次分別是芝麻香型、兼香型、濃香型；這也符合范文來等[17]在文獻中提到的醬香型白酒中吡嗪類化合物含量最高的說法。

表5 白酒中5種吡嗪類化合物的含量 (mg/L)

3 結論

通過優化實驗條件,采取選擇反應監測模式(SRM 模式)，建立了一種氣相色譜四級桿串聯質譜(GC-MS/MS)快速定量方法，可在12 min 內完成白酒中5 種吡嗪類化合物的定量分析,該方法采用直接進樣的方式，既節約了前處理所需時間,也減少了目標物在前處理過程中的損失，更加適用于企業的定量分析。在該方法條件下，5 種吡嗪類標準物質都具有良好的線性關系，相關系數在0.9904～0.9994，相對標準偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法檢出限在10～14 μg/L，加標回收率在98.52%～103.46%,線性關系、精密度、檢出限和加標回收率均滿足白酒中吡嗪類痕量物質檢測的實驗要求。

本實驗結果顯示，在醬香型白酒中，5種吡嗪的總含量最高，可達20.15 mg/L，濃香型白酒最高可達3.66 mg/L；在所有白酒樣品中，5 種吡嗪類化合物中四甲基吡嗪含量最高，其中醬香型白酒中最高可達11.67 mg/L。由于中國白酒的香型工藝種類繁多，白酒的風格特點也各不相同，還需要進一步加大研究的范圍，并進行定量檢測。